Efeito de crises convulsivas e fármacos antiepilépticos em parâmetros neuroquímicos e moleculares em peixe zebra (Danio rerio)

Abstract

Epilepsy is a neurological disorder characterized by the occurrence of spontaneous and recurrent seizures. This disease and its treatment influence diverse neurological pathways. The purinergic system is an essential route for cell-to-cell communication and employs extracellular nucleotides and nucleosides as signaling molecules. The neurotransmitter ATP mediates synaptic currents through activation of G-proteincoupled P2Y receptors and P2X ionotropic receptors. The ATP degradation and consequent production of adenosine is promoted by a family of enzymes named ectonucleotidases, which includes NTPDases (nucleoside triphosphate diphosphohydrolases) and ecto-5´-nucleotidase. Adenosine is a neuromodulator that acts through the activation of P1 metabotropic receptors (A1, A2A, A2B, and A3). Adenosine can acts as an endogenous anticonvulsant, mainly by A1 receptors. The NTPDases hydrolyze both tri- and diphosphonucleosides whereas ecto-5’- nucleotidase hydrolyzes nucleoside monophosphates producing the nucleoside adenosine, that is hydrolyzed by adenosine deaminase (ADA). Therefore, NTPDases, ecto-5’-nucleotidase, and ADA control nucleotide and nucleoside levels, modulating the purinergic signaling. In the cholinergic system, acetylcholine (ACh) acts through muscarinic (metabotropic) and nicotinic (ionotropic) receptors. ACh is inactivated by its hydrolysis, that is catalyzed by acetylcholinesterase (AChE). Zebrafish is a small freshwater teleost which is becoming widely used as an experimental organism. Studies have demonstrated that zebrafish could be an important model to study seizures and to screen antiepileptic drugs. Considering that the purinergic and cholinergic systems exert an important role in the nervous system and that these neurotransmitter pathways have been already described in zebrafish, the aim of this study was to evaluate in this teleost the effect of pentylenetetrazole (PTZ)-induced seizures and antiepileptic drugs on the ectonucleotidases, ADA, and AChE activities. We have tested the in vitro effects of carbamazepine, phenytoin, and gabapentine at different concentrations on ectonucleotidase and AChE activities. Our results have shown that carbamazepine reduced ATP and ACh hydrolysis whereas phenytoin enhanced AMP hydrolysis. Gabapentin did not promote any changes on enzymatic activities. In addition, we tested the effect of PTZ-induced seizures on ectonucleotidases and ADA activities in adult zebrafish brain. Our results have demonstrated that PTZ treatments did not alter ectonucleotidase and ADA activities in membranes and soluble fraction, respectively. However, ecto-ADA activity was significantly decreased in brain membranes of animals exposed to PTZ treatments. These results have shown that antiepileptic drugs can influence the enzyme activities involved in the degradation of ACh and extracellular nucleotides. Furthermore, the decreased adenosine deamination observed in our study suggests the ADA participation on the modulation of extracellular adenosine levels during PTZinduced seizures in zebrafish.

A epilepsia é uma desordem neuronal caracterizada pela ocorrência de convulsões espontâneas e recorrentes. Essa patologia e seu tratamento interferem em diversos mecanismos neurológicos. O sistema purinérgico é uma importante rota de sinalização celular que emprega nucleotídeos e nucleosídeos extracelulares como moléculas sinalizadoras. O neurotransmissor ATP atua através de receptores do tipo P2Y, acoplados à proteína G e receptores P2X, que são ionotrópicos. A degradação do ATP extracelular e a conseqüente produção de adenosina é realizada por uma família de enzimas de superfície celular conhecidas como ectonucleotidases, que inclui as NTPDases (nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases) e a ecto-5´-nucleotidase. A adenosina é um neuromodulador que atua através da ativação de receptores metabotrópicos do tipo P1 (A1, A2A, A2B, A3). Esse nucleosídeo pode agir como um anticonvulsivante endógeno, principalmente via receptores A1. As NTPDases hidrolisam nucleotídeos tri- e difosfatados originando a adenosina, que é hidrolisada pela adenosina deaminase (ADA). Assim, as NTPDases, ecto-5’-nucleotidase e ADA controlam os níveis de nucleotídeos e nucleosídeos, modulando o sistema purinérgico. No sistema colinérgico, a acetilcolina (ACh) atua através de receptores muscarínicos (metabotrópicos) e nicotínicos (ionotrópicos). Sua ação é encerrada através de sua hidrólise catalisada pela acetilcolinesterase (AChE). O peixe zebra é um pequeno teleósteo de água doce que vem sendo amplamente utilizado como modelo experimental em pesquisa. Estudos mostram que o peixe zebra pode ser uma ferramenta importante para o entendimento da epilepsia, bem como para o screening de fármacos antiepilépticos. Considerando que as sinalizações purinérgica e colinérgica têm importante participação no sistema nervoso e que essas vias de neurotransmissão estão identificadas e caracterizadas em peixe zebra, o objetivo desse estudo foi avaliar nesse teleósteo o efeito de convulsões induzidas por pentilenotetrazol (PTZ), bem como de fármacos antiepilépticos na atividade das ectonucleotidases, ADA e AChE, enzimas essenciais na modulação destas vias de sinalização. Foram avaliados os efeitos in vitro da carbamazepina, fenitoína e gabapentina na atividade das ectonucleotidases e AChE. A carbamazepina diminuiu a hidrólise de ATP e também de ACh. A fenitoína aumentou a hidrólise de AMP e a gabapentina não provocou alterações enzimáticas. Foi analisado também o efeito de crises convulsivas induzidas por PTZ na atividade das ectonucleotidases e da ADA. Os resultados não mostraram alterações nas ectonucleotidases e ADA nas frações extracelular e intracelular, respectivamente. No entanto, a atividade extracelular da ADA foi inibida em animais expostos ao PTZ. As análises mostraram que os fármacos antiepilépticos podem influenciar a atividade das enzimas envolvidas na degradação extracelular de nucleotídeos, bem como na hidrólise de ACh. Além disso, a diminuição na degradação de adenosina observada em nosso modelo de estudo pode sugerir a participação da ADA na modulação nos níveis de adenosina durante as crises convulsivas em peixe zebra.