Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10923/1357
Type: doctoralThesis
Title: Avaliação da toxicidade induzida pela exposição à microcistina-LR sobre as neurotransmissões colinérgica e purinérgica em Zebrafish (Danio rerio)
Author(s): Kist, Luiza Wilges
Advisor: Bogo, Maurício Reis
Publisher: Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul
Graduate Program: Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Issue Date: 2012
Keywords: BIOLOGIA CELULAR
BIOLOGIA MOLECULAR
NEUROTRANSMISSORES
TOXICIDADE
Abstract: Microcystins (MCs) constitute a family of cyanobacterial toxins, with more than 80 variants. These toxins are able to induce hepatotoxicity in several organisms, mainly through the inhibition of protein phosphatases PP1 and PP2A and oxidative stress generation. Recent evidence shows that MCs can either accumulate in brain or alter behavior patterns of fish species. Thus, this thesis aimed to study the effects of MC-LR (with the variable amino acids leucine (L) and arginine (R)) exposure on biochemical parameters in zebrafish, emphasizing the cholinergic and purinergic signaling, as well as to evaluate the behavioral patterns and whole-body cortisol levels. In vivo studies showed that 100 μg/L MC-LR for 24 h led to a significant increase in the AChE activity (27%) when zebrafish were exposed to the toxin dissolved in water, but did not cause any significant changes when injected intraperitoneally. In addition, semiquantitative RT-PCR analysis demonstrated that 100 μg/L MC-LR exposure also increased ache mRNA levels in zebrafish brain. The in vitro assays did not reveal any significant changes in AChE activity. We also assessed behavioral patterns and whole-body cortisol levels of adult zebrafish exposed to cell culture of the microcystin-producing cyanobacterium Microcystis aeruginosa. MC-LR exposure (100 μg/L) decreased by 63% the distance traveled and increased threefold the immobility time when compared to the control group. Interestingly, no significant alterations in the number of line crossings were found at the same MC-LR concentration and time of exposure. When animals were exposed to 50 and 100 μg/L, MC-LR promoted a significant increase (around 93%) in the time spent in the bottom portion of the tank, suggesting an anxiogenic effect. In addition, the results also showed that none of the MC-LR concentrations tested promoted significant alterations in absolute turn angle, path efficiency, social behavior, or whole-body cortisol level. Moreover, we evaluated the acute effects of different concentrations of MC-LR on NTPDases (nucleoside triphosphate diphosphohydrolases) and 5'- nucleotidase in adult zebrafish (Danio rerio) brain membranes. The results have shown no significant changes in ATP, ADP and AMP hydrolysis in zebrafish brain membranes. MC-LR in vitro also did not alter ATP, ADP and AMP hydrolysis in the concentrations tested. These findings show that acute exposure to MC-LR did not modulate ectonucleotidases activity in the tested conditions. Taken together these findings provide the first evidence that brain AChE is another potential target for MCs and that MC-LR exposure significantly impairs animal`s exploratory performance. Nevertheless, further studies including long-time exposure should be performed in order to achieve a better understanding about MCLR toxicity mechanisms in the central nervous system.
Microcistinas (MCs) constituem uma família de toxinas, com mais de 80 variantes. Estas toxinas são capazes de induzir hepatotoxicidade em diversos organismos, principalmente através da inibição das fosfatases PP1 e PP2A e geração de estresse oxidativo. Evidências recentes mostram que MCs podem acumular no cérebro e alterar padrões comportamentais em diferentes espécies de peixes. Portanto, a presente tese teve por objetivo estudar os efeitos da exposição à MC-LR (com os aminoácidos variáveis leucina (L) e arginina (R)) sobre parâmetros bioquímicos em zebrafish, enfatizando os sistemas colinérgicos e purinérgicos, bem como, avaliar padrões comportamentais e níveis de cortisol corporal. Resultados do estudo in vivo mostraram que a exposição a 100 μg/L de MC-LR durante 24 h causaram um aumento significativo na atividade da AChE (27%) quando zebrafish foi exposto à toxina dissolvida em água; porém, a toxina não causou mudanças significativas quando injetada intraperitonealmente. Além disso, a análise semiquantitativa de RT-PCR demonstrou que a exposição à 100 μg/L de MC-LR também aumentou os níveis de RNAm da ache em cérebro de zebrafish. Os ensaios in vitro não revelaram nenhuma alteração significativa na atividade da AChE. Nós também avaliamos padrões comportamentais e níveis de cortisol corporal de zebrafish adultos expostos à cultura de células de Microcystis aeruginosa produtoras de MC-LR. A exposição à MC-LR (100 μg/L) diminuiu em 63% a distância viajada e aumentou três vezes o tempo de imobilidade quando comparado ao grupo controle. Interessantemente, não houve alteração no número de linhas cruzadas na mesma concentração e tempo de exposição à MC-LR. Quando animais foram expostos a 50 e 100 μg/L, a MCLR promoveu um aumento significante (aproximadamente 93%) no tempo gasto na porção inferior do aquário teste, sugerindo um efeito ansiogênico. Adicionalmente, os resultados também mostraram que nenhuma das concentrações de MC-LR testadas promoveu alterações significativas nas mudanças de ângulo, eficiência de rota e interação social ou, no nível de cortisol corporal total. Além disso, também foi avaliado o efeito de diferentes concentrações de MC-LR na atividade das NTPDases (nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase) e 5’nucleotidase em membranas cerebrais de zebrafish (Danio rerio) adultos. Os resultados mostraram que não houve alteração nas hidrólises de ATP, ADP e AMP. Nos experimentos in vitro também não houve alteração nas hidrólises dos nucleotídeos nas concentrações testadas. Estes achados mostram que exposição aguda à MC-LR não modulou a atividade das ectonucleotidases nas condições testadas. Ademais, fornecem a primeira evidência que a AChE cerebral é um outro alvo potencial das MCs e que exposição à MC-LR prejudica significativamente a performance exploratória do animal. Estudos futuros incluindo exposição de longo prazo dever ser feitos para um melhor entendimento dos mecanismos de toxicidade das MCs no Sistema Nervoso Central.
URI: http://hdl.handle.net/10923/1357
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