| Resumo: | A presente tese está dividida em duas partes: na parte I, comparou-se a regeneração
óssea em camundongos fêmeas e machos, com diabetes do tipo 1 (T1D). Na parte II, foi
avaliada a regeneração óssea no modelo de menopausa experimental induzido por ovariectomia
(OVX), com ou sem T1D. Na parte I, os animais (machos e fêmeas) foram divididos em dois
grandes grupos: controle e T1D (induzido por estreptozotocina; STZ). Na parte II, os animais
foram divididos em quatro grandes grupos: fêmeas falso-operadas e OVX, com ou sem T1D.
Após a indução do T1D, foi criado um defeito ósseo monocortical no fêmur. Nas duas partes
do trabalho, foram avaliados os efeitos da suplementação com vitamina D3 e/ou insulina. Na
segunda parte, também se avaliou o efeito da reposição hormonal com estradiol. Decorridos 21
dias do procedimento da criação do defeito, os animais foram eutanasiados; o fêmur e o sangue
foram coletados para análises posteriores. Tanto as fêmeas, quanto os machos T1D,
apresentaram uma redução do ganho de peso corporal, associado à hiperglicemia. Não houve
alterações nos níveis séricos das citocinas pró-inflamatórias interleucina-1b (IL-1b), fator de
necrose tumoral (TNF) ou interferon-g (IFNg). Os animais T1D, de ambos os sexos,
apresentaram um comprometimento na regeneração óssea, como demonstrado pelas análises
histológicas e de micro-CT. A suplementação com vitamina D3 reestabeleceu a regeneração
óssea em fêmeas e machos T1D, apresentando valores próximos aos encontrados nos animais
do grupo controle. A terapia com insulina melhorou a remodelação óssea nas fêmeas e machos
T1D; porém, os efeitos foram mais pronunciados nos machos. A avaliação da atividade
osteoclástica não revelou diferenças significativas entre os grupos experimentais, após a
indução de T1D, em machos ou fêmeas. Os resultados do PCR em tempo real para runx2 e
osterix (dois fatores de transcrição relacionados aos osteoblastos), no tecido ósseo, não
demonstraram nenhuma diferença significativa, exceto por um aumento nos níveis de RNAm
dos dois fatores nos camundongos machos T1D, que receberam suplementação com vitamina D3. Por outro lado, fêmeas T1D que receberam vitamina D3 apresentaram um aumento na
expressão dos níveis de RNAm para o fator de crescimento semelhante à insulina do tipo 1
(IGF-1), quando comparado com os machos que tiveram o mesmo tratamento, sugerindo assim,
diferenças relacionadas ao sexo. Além das análises já mencionadas anteriormente, na parte II
da tese, parâmetros comportamentais e níveis séricos de cálcio e fosfatase alcalina também
foram analisados. Os resultados da segunda parte do trabalho demonstraram que os animais
submetidos a OVX tiveram um aumento do peso corporal, com atrofia uterina. Em
contrapartida, quando foi induzido T1D, houve uma diminuição do peso corporal mais
acentuada no grupo OVX que no grupo falso-operado. Os animais falso-operados e OVX T1D
apresentaram hiperglicemia, confirmando o desenvolvimento do diabetes. Os níveis séricos de
fosfatase alcalina foram divergentes entre os grupos não-diabéticos OVX e OVX T1D. Não
houve variações dos níveis de cálcio. Os animais falso-operados T1D, não diabéticos OVX e
OVX T1D apresentaram prejuízos similares na regeneração óssea, como observado pelas
análises histológicas e imagens de micro-CT. A reposição com estradiol melhorou a
cicatrização óssea nos animais não-diabéticos OVX e OVX T1D. Houve uma tendência ao
aumento nos níveis de RNAm de IGF-1 no grupo OVX, o que não foi observado quando da
associação de T1D e menopausa. Não foram observadas diferenças na atividade locomotora
dos animais com T1D e/ou OVX, a não ser por uma diminuição no número de rearings no
grupo falso-operado T1D, independente do tratamento com vitamina D3, insulina e estradiol,
de forma isolada ou em associação.
This thesis encompasses two parts: firstly, we compared the bone healing in female and
male mice, after induction of type 1 diabetes (T1D); secondly, the bone regeneration was
evaluated in a menopause model induced by bilateral ovariectomy (OVX), with or without T1D
induction. For the part I, the animals (female and male) were initially assigned into two groups,
namely control or T1D (elicited by streptozotocin; STZ). In the part II, the females were divided
into four experimental groups: sham-operated or OVX, with or without STZ T1D induction.
After T1D induction, a monocortical femoral defect was created. In either parts of the present
study, we evaluated the effects of supplementation with vitamin D3 and/or insulin. In the
second part, the effects of estrogen replacement were also analyzed. Following 21 days of bone
defect creation, the animals were euthanized; the femurs and blood were collected for posterior
analysis. Both T1D females and males presented a reduction in body weight gain, associated
with hyperglycemia. There were no changes in the serum levels of the pro-inflammatory
cytokines [interleukin-1b (IL-1b), tumor necrosis factor (TNF) and interferon-g (IFN-g)] in all
the evaluated groups. T1D mice of both sexes presented a delayed bone regeneration, according
to the histological and micro-CT assessment. The supplementation with vitamin D3 restored
the bone healing in female and male T1D mice, reaching values close to controls. The insulin
therapy improved the bone remodeling in T1D mice of both sexes, but the effects of this
hormone were superior in males. The evaluation of osteoclast activity did not reveal significant
differences among the experimental groups. Real time PCR revealed slight differences in the
mRNA expression of two transcription factors related to osteoblast differentiation, namely
runx2 and osterix, as measured in the area into the bone defect. A higher upregulation of both
factors was seen in T1D males treated with vitamin D3. Conversely, vitamin D3-treated T1D
females displayed an upregulation of insulin-like growth factor 1 (IGF-1), further indication
sex-related differences for the treatments. Besides the experimental protocols described for the part I of this thesis, in the part II, we also evaluated some behavioral locomotor parameters and
serum levels of calcium and alkaline phosphatase. OVX animals presented increased body
weight gain, accompanied by uterus atrophy. Otherwise, T1D induction elicited a reduction of
body weight gain, which was more pronounced in OVX-T1D animals. Serum levels of alkaline
phosphatase were divergent in the non-diabetic and T1D OVX animals. Calcium or cytokine
levels were similar in all the experimental groups. The sham-operated T1D, the non-diabetic
OVX and the OVX-T1D groups presented a delayed bone regeneration, as indicated by
histological and micro-CT analysis. Estrogen replacement improved the bone healing in all
OVX groups. There was a trend toward an upregulation of IGF-1 mRNA in non-diabetic OVX
animals, which was not mirrored in OVX-T1D mice. Locomotor parameters remained
unaltered, except by a general reduction of rearing numbers in T1D animals. |
