Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10923/1382
Type: masterThesis
Title: Expressão e purificação do domínio Ets do fator de transcrição Spi-C humano recombinante: ensaios de ligação a promotores de linfócitos B
Author(s): Gianniotis, Ekaterini
Advisor: Bogo, Maurício Reis
Publisher: Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul
Graduate Program: Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Issue Date: 2008
Keywords: BIOLOGIA CELULAR
BIOLOGIA MOLECULAR
DNA
PROTEÍNAS
Abstract: The members of the Ets family of transcription factors contain a DNA binding domain called Ets, which recognizes a purine rich sequence that has a central 5’-GGAA/T-3’ core. The Ets domain can be produced as a protein fragment that can independently fold into a stable structure, and it is sufficient to bind DNA by itself. The Spi-C protein is member of the subfamily Spi and is characterized by being expressed during different stages of B cell development and also in macrophages. There are some published works describing that Spi-C recognizes some of the DNA sequences which were previously studied for PU. 1 protein, a member of the same subfamily. The expression of Spi-C overlaps the one of PU. 1 during B cell development. There are genes involved in B cell development whose promoters have Ets binding sites. Binding studies for Spi-C can contribute to some issues about this transcription factor function and the regulation of these genes transcription. In this work, we present the heterologous expression of human Spi-C in Escherichia coli and its purification by FPLC yielding approximately 0. 7 mg of protein per cell gram. Here, to investigate new target promoter sequences for Spi-C, DNA binding studies were done using sequences localized at promoters of genes that codify for the α subunit of the IL-7 receptor and for the B cell receptor complex transmembrane protein Igα. These proteins participate in the development of B cells and are essential for their selection in the bone marrow. Our results show that Spi-C Ets domain is capable of recognizing and binding these DNA sequences by electrophoretic mobility shift assays forming different sized complexes. We suggest that Ets domain can bind to DNA sequences in vitro in a proportion higher than 1:1; the higher was the domain concentration, the more retarded were the protein-DNA complexes. Surprisingly, the Ets domain was not able to discriminate between the wild sequences, from the ones with mutations in the central core, maintaining the same shift pattern, suggesting that for DNA recognition the other parts of the protein are fundamental.
Os membros da família de fatores de transcrição Ets contêm um domínio de ligação ao DNA, chamado domínio Ets, que reconhece uma seqüência rica em purinas, cujo consenso central é formado pela seqüência 5’-GGAA/T-3’. O domínio Ets pode ser produzido como um fragmento de proteína que se enovela independentemente, numa estrutura estável, sendo suficiente para que ocorra ligação ao DNA. A proteína Spi-C pertence à subfamília Spi e se caracteriza por ser expressa durante diferentes estágios do desenvolvimento de células B e em macrófagos. Existem alguns trabalhos publicados que descrevem o reconhecimento por Spi-C de algumas seqüências de DNA, previamente estudadas para a proteína PU. 1, membro da mesma subfamília. A expressão de Spi-C sobrepõem-se com a de PU. 1 ao longo do desenvolvimento das células B. Existem promotores de genes envolvidos no desenvolvimento de células B que contêm sítios para a ligação de proteínas Ets. Estudos quanto à ligação da Spi-C nos mesmos podem contribuir para acrescentar dados sobre a função desse fator de transcrição e sobre a regulação da transcrição desses genes. Neste trabalho, apresentamos a construção do gene, a expressão heteróloga do domínio Ets da proteína Spi-C humana em Escherichia coli e a sua purificação por FPLC com rendimento de aproximadamente 0,7mg de proteína por grama de célula. Com o objetivo de investigar novas seqüências promotoras alvo para Spi-C, foram realizados estudos de ligação a seqüências de DNA localizadas nos promotores dos genes que codificam para a subunidade do receptor de IL-7 e para a proteína transmembrana integrante do complexo receptor de células B, Igα. Estas proteínas participam do desenvolvimento de células B e são essenciais para a seleção das mesmas na medula óssea. Nossos resultados demonstram que o domínio Ets de Spi-C reconhece e se liga a essas seqüências de DNA (migração em gel) formando complexos de diferentes tamanhos. O domínio Ets foi capaz de se ligar a seqüências de DNA in vitro numa proporção maior do que 1:1 sendo que, quanto maior a concentração do domínio maior foi o retardo do DNA no gel. Surpreendentemente, o domínio Ets não foi capaz de discriminar as seqüências selvagens, daquelas com mutações no consenso central de ligação, mantendo o mesmo perfil de retardo das bandas, sugerindo que o restante da proteína é importante para esse reconhecimento.
URI: http://hdl.handle.net/10923/1382
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