Padronização de um paradigma comportamental de esquiva inibitória para Zebrafish (Danio rerio Hamilton, 1822)

Abstract

Memories are stored as structural and functional changes of the synaptic connections in neural regions involved in learning. Due to its biological relevance and relation to pathologies of the human nervous system, the pursuit for elucidation of the mechanisms underlying its maintenance is receiving enormous interest from distinct areas of knowledge over the years. Studies on the neural mechanisms of long-term memories have demonstrated that its formation is a gradual process involving neuroanatomical and cellular substrates, and whose molecular bases are the target of intense research. The teleost fish zebrafish is an excellent animal model for genetic and developmental studies and has a great potential for studies of learning and memory. This vertebrate is easy to manipulate and has a fast external development demanding practical and economical maintenance. Neuroanatomicaly, despite differences on developmental aspects and brain regions’ disposition, the general organization of mammal and teleost brains follow typical vertebrates’ patterns. Recent advances have shown that there is extensive similarity in both complexity and functioning of teleosts fish and terrestrial vertebrates brains, which validates the use of this animal model to study conserved mechanisms of learning and memory. Although there are studies evaluating behavior of zebrafish, they are mainly focused on locomotion and exploration of the environment in detriment of cognition. Moreover, there is no consistency in relation to the tasks protocols used. In the present study we demonstrate a rapid and effective learning protocol of a single-trial inhibitory avoidance to zebrafish that would allow the evaluation of cellular and molecular mechanisms of memory formation in vertebrates. In a simple apparatus animals learn to avoid swimming from a white into a dark compartment in order to circumvent an electric shock in a single training session. The retention test was performed 24 h after training. The test session repeated the training protocol except that no shock was administered. Latencies to enter the dark environment were considered indication of retention. In order to demonstrate the task potential use in further studies aiming to characterize the effect of pharmacological treatments that alter animals’ cognitive performance, we investigated the effect of the NMDA-receptor antagonist on inhibitory avoidance memory. Immediately after training animals were treated with 20 μM of MK-801 during 15 min, which prevented memory formation. Our results shows that the resulting memory for this task is robust, long-lasting and sensitive to NMDA blockage, in accordance to data from other vertebrates. This is a powerful instrument for evaluate memory processes and many other studies may benefit from this task. Together with complementary strategies available for zebrafish it may significantly improve our current knowledge on learning and memory mechanisms.

Memórias são armazenadas como modificações estruturais e funcionais das conexões sinápticas nas regiões neurais envolvidas no aprendizado e, por sua relevância biológica e relação com patologias do sistema nervoso humanas, a busca pela elucidação dos mecanismos responsáveis por sua manutenção tem recebido interesse de distintas áreas do conhecimento ao longo dos anos. Estudos sobre os mecanismos neurais das memórias de longa duração demonstraram que sua formação é um processo gradual que envolve substratos neuroanatômicos e celulares agora conhecidos em grande extensão, e cujas bases moleculares são alvo de intensa investigação. O peixe teleósteo zebrafish é um excelente modelo animal para estudos genéticos e de desenvolvimento e vêm mostrando enorme potencial para estudos de aprendizagem e memória. Este vertebrado de fácil manipulação apresenta rápido desenvolvimento externo e manutenção prática e econômica. Em termos neuroanatômicos, apesar das diferenças entre aspectos do desenvolvimento e resultante disposição de regiões cerebrais de mamíferos e teleósteos, a organização geral do encéfalo do zebrafish segue padrões típicos dos vertebrados. Avanços recentes no conhecimento demonstram que há uma extensa similaridade, tanto em complexidade quanto em funcionamento entre o cérebro de peixes teleósteos e os vertebrados terrestres o que valida o uso deste modelo animal para estudo dos mecanismos conservados do aprendizado e memória. Embora já existam na literatura científica estudos avaliando parâmetros comportamentais do zebrafish, na maior parte das vezes o foco principal dos trabalhos não é a cognição. Aspectos como locomoção e exploração do ambiente são tomadas como medidas e os trabalhos publicados não mostram constância em relação às tarefas utilizadas e protocolos adotados. Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de um novo paradigma de esquiva inibitória para zebrafish a fim de permitir a avaliação dos mecanismos celulares e moleculares da formação de memória em vertebrados. Para tanto, o treino consistiu de apenas uma sessão onde os animais foram colocados individualmente no aquário de esquiva inibitória. Ao cruzar para o lado escuro do aquário um choque elétrico foi administrado por 5s e estes animais retirados imediatamente do aquário. Na sessão de teste, realizada 24 h depois, seguiu-se o mesmo protocolo, porém nenhum choque foi utilizado. As latências de entrada no lado escuro para o treino e o teste foram consideradas como indicadoras de retenção. Para a validação da tarefa um grupo de animais foi tratado durante 15 min pós-treino com o antagonista de receptor NMDA MK-801 numa concentração de 20 μM. Os resultados obtidos demonstram que a tarefa de esquiva inibitória desenvolvida para zebrafish é baseada em mecanismos conservados em que o aprendizado, e resultante memória, são dependentes de sinalização glutamatérgica mediada por NMDA, assim como já evidenciado para outros vertebrados. A tarefa desenvolvida é rápida, simples e resulta em um aprendizado robusto, sólido e persistente, representando um instrumento valioso para se caracterizar diferentes processos que afetam o comportamento no zebrafish, bem como permitir a dissecação dos eventos tempos-dependentes da formação de memórias de vertebrados.