Efeito do estresse crônico imprevisível no metabolismo de nucleotídeos e nucleosídeos em encéfalo de zebrafish (Danio rerio)

Abstract

According to data from the World Health Organization (WHO), stress affects more than 90% of the world's population and is considered a global epidemy. Stress has become an integral part of human life and organisms are constantly subjected to stressful stimuli that change various physiological processes, representing a risk factor for many diseases, such as cancer, cardiovascular, metabolic, infectious and gastrointestinal deseases and depression. The zebrafish (Danio rerio) has many similarities with mammalian in terms of overall organization and the functioning of their stress regulatory systems. The zebrafish hypothalamic-pituitary-interrenal (HPI), analogous to the mammalian hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA), has been found in zebrafish and the activation of this pathway is essential for the maintenance of vital functions in response to stressful events. Despite extensive knowledge regarding stress responses in mammals, data on the relationship between chronic unpredictable stress and its effects on purinergic signaling is limited. Purinergic signaling is mediated by ATP and adenosine receptor activation through P2 and P1, respectively. The catabolism of extracellular ATP to adenosine is promoted by the ectonucleotidases, such as Ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolases (E-NTPDases) and ecto-5 '-nucleotidases (E-5´NT). Adenosine is deaminated by adenosine deaminase (ADA) producing inosine. Thus, these enzymes control the levels of extracellular nucleotides and nucleosides, exerting an influence on purinergic signaling. Considering some models of stress can affect the signalling systems, the objective of this study was to verify whether the unpredictable chronic stress changes ectonucleotidases and adenosine deaminase activities in zebrafish brain. In addition, we analyzed the metabolism of ATP as well as the expression of genes related to ADA, ada1, ada2. 1, ada2. 2, adaL, adaasi and the effects of agonists and antagonists of adenosine receptors in an unpredictable chronic stress model in zebrafish. Our results demonstrated that there are no changes on ATP (P = 0. 1499), ADP (P = 0. 3615) and AMP (P = 0. 8987) hydrolysis in zebrafish brain membranes submitted to unpredictable chronic stress. In contrast, ecto-ADA activity significantly decreased (26. 8%; 8,164 ± 0. 78 NH3 min − 1 mg− 1 of protein; p 0. 05; n = 5 <) in brain membranes of animals exposed to the unpredictable chronic stress when compared to the control group (11. 15 ± 2. 16 NH3 min − 1 mg − 1 of protein; p 0. 05; n = 5). However, the activity of cytosolic ADA was not changed after the unpredictable chronic stress. Quantitative analysis by RT-qPCR did not show significant changes after chronic unpredictable stress exposure on gene expression in the genes ada1, ada2. 1, ada2. 2, adaL, adaasi. ATP metabolism in brain membrane preparations of zebrafish in the control group and stressed was measured by high-performance liquid chromatography (HPLC) and showed a significant increase of adenosine in stressed animals. Considering adenosine A1 receptor agonists have an anxyolitic activity and the A2A receptor antagonists can exert neuroprotective effects, we investigated the effect of administration of an agonist of A1 receptor, N⁶-ciclopentiladenosine (CPA), and an antagonist of A2A receptors, (ZM241385) on behavioral parameters of animals submitted to unpredictable chronic stress to check a possible relationship between the adenosinergic system and the stress. As a result we showed that these compounds have not been able to reverse the anxiogenic effect caused by unpredictable chronic stress. Since adenosine has neuromodulatory and anxiolytic effects, changes in its levels could play a role in counteracting the stress, which could be related to a compensatory mechanism in order to restore the homeostasis.

De acordo com dados da Organização Mundial de Saúde (OMS), atualmente o estresse afeta mais de 90% da população mundial, sendo considerado uma epidemia global. O estresse tornou-se parte integrante da vida humana e os organismos são constantemente submetidos a estímulos estressantes que alteram vários processos fisiológicos, sendo um fator de risco para diversas patologias, como câncer, doenças cardiovasculares, metabólicas, infecciosas, gastrointestinais e depressão. O peixe-zebra (Danio rerio) tem muitas semelhanças com mamíferos em termos de organização geral e o funcionamento dos respectivos sistemas reguladores do estresse. O eixo hipotálamo-pituitária-interrenal (HPI), um sistema análogo ao eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA), foi descrito em zebrafish e a ativação desta via é essencial para a manutenção das funções vitais como resposta a eventos estressantes. Apesar do amplo conhecimento das respostas do estresse em mamíferos, os dados sobre a relação entre o estresse crônico imprevisível e seus efeitos na sinalização purinérgica são limitados. A sinalização purinérgica é mediada por ATP e adenosina por meio da ativação dos receptores P2 e P1, respectivamente. O catabolismo de ATP extracelular até adenosina é promovido pelas ectonucleotidases, como as Ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases (E-NTPDases) e Ecto-5’- nucleotidases (E-5´NT). A adenosina produzida pode ser desaminada pela adenosina desaminase (ADA), produzindo inosina. Assim, estas enzimas controlam os níveis de nucleosídeos e nucleotídeos extracelulares, exercendo uma influência na sinalização purinérgica. Considerando que alguns modelos de estresse podem afetar os sistemas de sinalização, o objetivo deste estudo foi verificar se o estresse crônico imprevisível altera as atividades ectonucleotidásicas e adenosina desaminase em cérebro de zebrafish. Além disso, analisamos o metabolismo do ATP, bem como a expressão de genes relacionados à ADA, ada1, ada2. 1, ada2. 2, adaL, adaasi e os efeitos de agonistas e antagonistas de receptores de adenosina em zebrafish submetidos a um modelo de estresse crônico imprevisível. Nossos resultados demonstraram que não há alterações na hidrólise de ATP (P = 0. 1499), ADP (P = 0. 3615) e AMP (P = 0. 8987) em membranas cerebrais de zebrafish submetidos ao estresse crônico imprevisível. Em contraste, a atividade da ecto- ADA diminuiu significativamente (26,8%; 8. 164 ± 0,78 NH3 min−1 mg−1 de proteína; p < 0,05; n = 5) em membranas de cérebro de animais expostos ao estresse crônico imprevisível quando comparado ao grupo controle (11. 15 ± 2,16 NH3 min−1 mg−1 de proteína; p < 0,05; n = 5). No entanto, a atividade da ADA citosólica não foi alterada. A análise quantitativa por RT-qPCR não apresentou alterações significativas após a exposição do estresse crônico imprevisível na expressão gênica nos genes ada1, ada2. 1, ada2. 2, adaL, adaasi. O metabolismo do ATP em preparações de membrana de cérebro de zebrafish no grupo controle e estressado foi medido por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e mostrou um aumento significativo de adenosina nos animais estressados. Considerando que os agonistas de receptores A1 têm uma atividade ansiolítica e os antagonistas dos receptores A2A podem exercer efeitos neuroprotetores, investigamos o efeito da administração de um agonista do receptor A1, N⁶-ciclopentiladenosina (CPA), e de um antagonista de receptores A2A, (ZM241385) em parâmetros comportamentais de animais submetidos ao estresse crônico imprevisível, para verificar uma possível relação entre o sistema adenosinérgico e o estresse. Como resultado, observamos que esses compostos não foram capazes de reverter o efeito ansiogênico causado pelo estresse crônico imprevisível. Uma vez que a adenosina tem efeitos neuromodulatórios, as alterações nos níveis de adenosina podem desempenhar um papel nos mecanismos relacionados ao estresse, representando um mecanismo de compensação a fim de restaurar a homeostase.