| Resumen: | A utilização de técnicas de biologia molecular na solução de problemas de interesse forense constitui importante parcela das ferramentas disponíveis na execução de perícias de interesse criminal ou cível, sendo particularmente relevante em casos como identificação de suspeitos de envolvimento em fatos delituosos, reconhecimento de vítimas em eventos de desastre de massa, determinação de paternidade ou outras relações de parentesco biológico, entre outros tipos de eventos de interesse judicial onde a genética forense é empregada. Nesse contexto, a perícia criminal muitas vezes se defronta com problemas relacionados ao tipo de amostra criminal cuja análise é alvo dos exames: vestígios biológicos com baixíssima quantidade de DNA ou com elevado grau de degradação do mesmo (devido à exposição a fatores ambientais), presença de misturas de mais de um doador, entre outros. Tais situações representam um desafio ao analista, onde a disponibilidade de novas tecnologias na solução de casos críticos pode ser a única alternativa disponível para a resolução do crime. Técnicas de sequenciamento massivo paralelo (MPS) apresentam diversas vantagens para emprego em amostras criminais críticas, incluindo elevada sensibilidade, customização de painéis analíticos com inclusão de diferentes tipos de marcadores genéticos, capacidade de análise de amostras com elevado grau de degradação ou contaminação, quantidade significativa de informações geradas por uma única análise (possibilitando o processamento simultâneo de um grande número de amostras), entre outros.Dessa maneira, a inclusão das técnicas de MPS ao arsenal analítico disponível nas ciências forenses é indispensável, visando à solução de problemas forenses onde exames tradicionais são insuficientes ou não podem ser aplicados em razão das características da amostra. O presente trabalho propôs investigar a adequação e conveniência da implementação de técnicas de MPS junto ao Laboratório Regional de Genética Forense da Polícia Federal, com o intuito de inclusão de tais técnicas no arsenal analítico disponível para execução de exames de rotina na casuística da Polícia Federal. Nesse contexto, foram realizados estudos de eficiência de genotipagem em um sistema de MPS com um painel comercial contendo 90 SNPs autossômicos informativos com elevada heterozigosidade, e 34 SNPs de clado superior do cromossomo Y. Os estudos incluíram a determinação das frequências alélicas associadas aos marcadores na população brasileira e a avaliação de sua eficiência nos processos de identificação humana. Amostras oriundas de casos forenses reais (casework) foram também examinadas, com objetivo de comparação da adequação da nova técnica proposta quando confrontada com resultados obtidos por métodos tradicionais, além da avaliação do impacto da natureza biológica da evidência criminal na qualidade e eficiência de genotipagem destas amostras.A pesquisa incluiu uma análise da variabilidade e estrutura genética dos haplótipos do cromossomo Y no Brasil, diferenciando as cinco regiões demográficas do país, e buscando caracterizar as diferentes linhagens patrilineares que contribuíram para a formação da população brasileira. Ao total, mais de 400 amostras criminais ou de referência das cinco regiões brasileiras foram avaliadas com sucesso por esta metodologia, sendo obtidas as frequências alélicas e outros parâmetros de interesse forense relevantes par auso em estudos de identificação humana. Além do painel acima citado, o presente trabalho avaliou igualmente a eficiência de sequenciamento em linhagens uniparentais maternas de interesse forense. Assim, um painel comercial empregado no estudo do genoma mitocondrial completo foi avaliado quanto a sua capacidade de sequenciamento e adequabilidade para emprego em amostras da população brasileira. Este último estudo, um dos pioneiros na descrição de haplótipos de DNA mitocondrial com origem brasileira utilizando a sequência completa com um foco forense, incluiu um total de 96 amostras, no que pode ser considerado o embrião da organização de uma base de dados de genomas mitocondriais completos na população deste país, para uso em exames de interesse forense. Os resultados sugerem a adequabilidade dos métodos avaliados, os quais se mostraram apropriados para emprego na rotina analítica brasileira, com capacidade de geração de perfis genéticos ou haplótipos mitocondriais com adequada robustez, eficiência e confiabilidade.
Molecular biology techniques constitute a significant part of technical solutions available in forensic analysis for criminal or civil purposes. As such, these methods are particularly relevant in cases including crime suspects identification, mass disaster victim identification, paternity or other forms of kinship determination, among others. In this context, forensic analysis usually faces technical problems associated with the very nature of criminal biological evidence: samples with very low DNA amounts or in highly degraded conditions (usually due to environmental exposure), DNA mixtures including more than a single origin, background DNA contamination, inhibitors presence, and additional factors. This situation might represent a challenge to the analysts, where alternative technologies to traditional methods can be the only alternative for successful evaluation of some criminal evidences. Massive Parallel Sequencing (MPS) techniques present advantages in challenging samples processing including high sensitivity, flexibility for panel design including different kind of forensic markers and polymorphisms, adequacy for use with degraded or contaminated samples, simultaneous processing of a high number of samples and/or polymorphisms (as a result of barcoding alternatives and humongous amount of data generated in a single run), along with other benefits.Therefore, inclusion of these techniques to routine analytical repertoire is key to efficient solution of current forensic problems caused by limits associated with traditional DNA genotyping, sequencing and analysis methods. Adequacy and convenience of MPS techniques introduction and implementation in Brazilian Federal Police Forensic Genetics Regional Laboratory were evaluated in this project, in order to add such methods to available DNA analysis protocols in this facility. Genotyping efficiency studies were conducted in a commercial MPS panel including 90 highly heterozygous, informative SNP markers, as well as 34 high-clade Y-chromosome SNPs. Allelic frequencies for Brazilian populations and other relevant forensic descriptive indexes were estimated. In addition, efficiency of this method in real criminal casework samples was evaluated, and results compared to those obtained from traditional analysis methods. Impact of biological nature of criminal samples in genotyping efficiency was also analyzed.Finally, genetic variability and structure in Y-chromosome haplotypes distributions was assessed in Brazilian population, according to geopolitical regions, in order to describe paternal lineage contribution patterns to modern Brazilian populations. Over four hundred reference or criminal samples from all five Brazilian geopolitical regions were successfully evaluated, and resulting allele frequencies and forensic parameters obtained for human identification purposes. A second commercial solution was also evaluated in its efficiency to generate complete DNA sequences of forensic relevant uniparental lineages. Thus, complete mitochondrial genomes were obtained through MPS techniques, whose efficiency and adequacy to Brazilian samples were explored. This study aims to lay the groundwork of a future database containing full-genome mitochondrial Brazilian sequences, for forensic purposes. Obtained results suggest adequacy of evaluated methods, which were found to be appropriate for routine use in Brazilian forensic casework processing, with ability to generate robust, efficient and trustworthy genetic profiles from Brazilian criminal samples. |
