| Resumo: | A leishmaniose é considerada uma das principais doenças endêmicas do mundo e o Brasil está entre os países com a maior incidência das formas cutâneas e mucocutâneas de leishmaniose causadas principalmente pela Leishmania braziliensis. Embora o tratamento desta doença esteja disponível, os fármacos de primeira linha contra a leishmaniose possuem várias limitações: administração parenteral, longa duração do tratamento e muitos efeitos adversos. Uma das principais características metabólicas destes parasitas é a ausência da via de biossíntese de novo de purinas, tornando-os dependentes unicamente da via de salvamento para a síntese de nucleotídeos. A melhor compreensão da via de salvamento de purinas pode revelar detalhes da biologia de L. braziliensis que, por sua vez, podem ser usadas para desenvolver novas estratégias para combater este parasita. A Inosina-Uridina Nucleosídeo Hidrolase de L. braziliensis (LbIU-NH) desempenha um papel importante na rota de salvamento e é um alvo molecular interessante para o desenvolvimento de novos fármacos, uma vez que não existe uma atividade catalítica semelhante em mamíferos.Neste trabalho, descrevemos a clonagem, expressão e a purificação da proteína recombinante homogênea. A determinação das constantes cinéticas da LbIU-NH no estado estacionário para inosina, adenosina, citidina e uridina foram determinadas. Estes dados sugerem funções e características distintas de uma hidrolase não específica. O perfil termodinâmico sugere que apenas a ribose pode ligar à enzima livre com contribuições tanto entalpica (ΔH) quanto entrópica (ΔS) favoráveis. Os parâmetros de ativação termodinâmica (Ea, ΔG#, ΔS#, ΔH#) para a reação catalisada pela LbIU-NH, cinética no estado pré-estacionário, efeito isótopico do solvente e perfil de pH também foram determinados. Além disso, descrevemos a estrutura cristalina de LbIU-NH complexada com ribose e Ca2+ a 1.5 Å de resolução.
Leishmaniasis is considered one of the main endemic diseases in the world, and Brazil is among the countries, which has the highes t incidence of cutaneous and mucocutaneous forms of leishmaniosis caused mainly by Leishmania braziliensis . Although the treatment of this disease is available, the first line drugs against leishmaniosis have several limitations: parenteral administration, long duration of treatment, and serious toxicities. One key metabolic characteristic of th is parasite is the lack of purine de novo biosynthesis pathway, relying only on the purine salvage pathway for nucleotide synthesis. The better understanding of the purine salvage pathway can reveal details of the biology of L. braziliensis that could be used to develop new strategies to combat this parasite.The inosine uridine nucleoside hydrolase from L. braziliensis Lb IU NH) plays an important role in the salvage process and is an attractive drug target as there is no similar catalytic activity in mammals. Here, it is described the cloning, expression, and purification of the homogenous recombinant protein. Determination of Lb IU NH steady state kinetic constants f or inosine, adenosine, cytidine and uridine are reported. These data suggest distinct functions and characteristics of a nonspecific hydrolase. Thermodynamic profile suggests that only ribose can bind to free enzyme with favorable enthalpic ( Δ H) and entropic ( Δ S) contributions T hermodynamic activation parameters ( E a , Δ G ##, Δ S ##, Δ H ##) for the Lb IU NH catalyzed chemical reaction, pre steady state kinetics, solvent kinetic isotope effects, and pH rate profiles are also presented. In addition, the crystal structure of Lb IU NH in complex with ribose and Ca 2+ at 1.5 Å resolution is described. |
