Avaliação dos mecanismos de reparo de DNA por recombinação em células de carcinoma epidermóide de boca

Abstract

Com a finalidade de obter maiores conhecimentos sobre mecanismos de reparo de DNA no desenvolvimento do câncer bucal, foi avaliado o reparo da quebra da dupla fita de DNA (DSBs) em células de indivíduos com menos de 40 anos e com mais de 40 anos. O objetivo foi determinar se as células de carcinomas epidermóióides de boca de indivíduos com menos de 40 anos de idade e com mais de 40 anos diferem em relação à capacidade para reparar as DSBs por meio de ambos os mecanismos de reparo por recombinação, a recombinação homóloga (HR) e a junção de extremidades não homólogas (NHEJ). Foi acessada funcionalmente a quebra da dupla fita de DNA utilizando linhagens celulares UT-SCC desenvolvidas a partir de indivíduos com menos de 40 anos e com mais de 40 anos. Foi examinado o dano global de DNA pelo ensaio do cometa utilizando radiação ionizante (RI). Um total de 200 células por amostra foi analisado utilizando o sistema de análise de imagem, Komet software. Para a análise da capacidade das linhagens celulares UT-SCC repararem o dano ao DNA por HR e NHEJ, foi utilizado um ensaio com plasmídeo, descrito por Secretan et al. , 2004. No ensaio do cometa foram realizados três experimentos independentes para cada linhagem celular, e não foi observada diferença entre as linhas celulares provenientes de indivíduos com menos de 40 anos e com mais de 40 anos em relação ao reparo das DSBs de forma global. Quando foram comparadas células irradiadas versus células não-irradiadas, observou-se que ambas as linhagens de celulares foram capazes de reparar as DSBs causadas pela radiação ionizante em um período de 24 horas.Para testar se houve deficiência ou compensação de um mecanismo de reparo sobre o outro, foi realizada uma análise de HR e NHEJ, na qual se observou que tanto nas linhagens celulares de indivíduos com menos de 40 anos quanto nas dos com mais de 40 houve uma redução em ambos os mecanismos de reparo por recombinação, quando comparados à linhagem celular de ceratinócitos normais. Com base nos resultados, concluiu-se que as linhagens celulares de indivíduos com menos de 40 anos, bem como os com mais de 40 anos, têm seus mecanismos de reparo por recombinação reduzidos. Não há diferença estatisticamente significante na eficiência de recombinação NHEJ entre as linhagens celulares UT-SCC de indivíduos jovens e com mais de 40 anos. Há uma maior redução no reparo das DSBs por HR em linhagens celulares de indivíduos com mais de 40 anos.

To gain a further insight into DNA repair mechanisms for oral squamous cell carcinoma (OSCC) in younger and older patients. Our main goal was to determine if young and older patients differ in their ability to repair doublestranded breaks (DSBs) by both Homologous Recombination (HR) and Nonhomologous End-Joining (NHEJ). We have functionally assessed doublestranded breaks using UT-SCC cell lines established from young (<40 yr. ) and older ( 40 yr) patients. We have examined global DNA damage using the Comet assay after cell exposure to ionizing radiation (IR). In the Comet assay, cells are embedded in agar, cell membranes are removed by lysis, the DNA is allowed to unwind, and electrophoresis is performed using an alkaline pH buffer. Loops of DNA around strand breaks are more relaxed, and they are pulled towards the anode, appearing to have a comet “tail”. Undamaged DNA remains tightly wound in the nucleoid, or comet “head”. Tail moments were used to measure the degree of DNA fragmentation. Cells were irradiated (20 Gy), and collected at different points in time. After electrophoresis, cells were stained with ethidium bromide, and observed under a fluorescent microscope. A total of 200 cells per sample were analyzed using the Komet image analysis system. HR and NHEJ analyses were performed using a plasmid-based repair assay, in order to measure the ability of the UT-SCC cell lines undergo DNA DSB repair. In order to assess global DNA DSB repair, three independent experiments were performed for all cell lines using the Comet assay, and no differences were found between lines derived from younger and older patients when comparing irradiated vs. nonirradiated cells. We have also observed that both young and old patients’ cell lines are able to repair DNA DSBs caused by ionizing radiation in about 24 hrs.To test whether there is a deficiency or compensation from one DSB mechanism, the analysis of homologous recombination and non-homologous end-joining was employed. We have observed that both young and old patients’ UT-SCC cell lines showed deficient double-stranded break repair with both mechanisms. However homologous recombination efficiency was largely compromised in UTSCC cell lines derived from older patients.