| Resumen: | A tuberculose humana (TB) é uma doença infectocontagiosa provocada principalmente pelo Mycobacterium tuberculosis e permanece sendo um importante problema mundial de saúde. Estima-se que 8,7 milhões de novos casos tenham ocorrido em 2011. Problemas relacionados ao tratamento da infecção ocorrem devido à sua habilidade de persistir de forma latente no hospedeiro criando um reservatório da doença. Adicionalmente, a emergência de cepas multi, extensivamente e totalmente resistentes, a coinfecção TB-HIV e a complexidade do tratamento utilizado atualmente, alertam para a necessidade de novos medicamentos, que possuam novos mecanismos de ação. A enzima adenilossuccinato liase (ASL) está envolvida em ambas as vias de biossíntese de purinas. Neste trabalho, nós descrevemos a amplificação, clonagem da ASL de M. tuberculosis (MtASL) e expressão em Escherichia coli. O sequenciamento N-terminal juntamente com análises por espectrometria de massas confirmaram a identidade da MtASL homogênea. Foi demonstrado através de cromatografia de exclusão por tamanho que a proteína é um homotetrâmero em solução. Ensaios de cinética no estado estacionário revelaram que a MtASL exibe um modelo de cinética hiperbólica e que catalisa a clivagem de S-AMP a AMP e fumarato. Estudos de perfil de pH demonstraram que a MtASL realiza um mecanismo catalítico ácido-básico e, tais estudos, combinados ao alinhamento múltiplo de sequências, permitiram propor os resíduos de aminoácidos envolvidos na reação. Adicionalmente, estudos de inibição pelos produtos somados a estudos de calorimetria de titulação isotérmica da ligação dos mesmos, permitiram propor o mecanismo cinético da MtASL. Os resultados deste trabalho podem auxiliar na posterior identificação de análogos de nucleotídeos que sejam capazes de inibir a viabilidade do M. tuberculosis, com poucos danos ao hospedeiro humano.
Human tuberculosis (TB), an illness that results from Mycobacterium tuberculosis infection, remains a major health problem worldwide, accounting for an estimated 8. 7 million new cases globally in 2011. Problems related to treatment of M. tuberculosis infection are related to its ability to persist latently in host tissues, getting protection against drug treatment and creating a reservoir of disease. Addictionaly, the emergence of multi, extensively and totally drug-resistant strains, TB-HIV co-infection and the complexity of the treatment currently used, underline the need of new antitubercular drugs, with novel mechanisms of action. The enzyme adenylosuccinate lyase (ASL) is involved in both de novo and salvage pathways of purine biosynthesis. Here we describe M. tuberculosis ASL (MtASL) cloning and expression in Escherichia coli. N-terminal amino acid sequencing and electrospray ionization mass spectrometry analyses confirmed the identity of homogeneous MtASL. Size exclusion chromatography showed that the protein is a homotetramer in solution. Steady-state kinetics revealed that MtASL exhibits hyperbolic kinetics and confirmed that the recombinant enzyme indeed catalyses the cleavage of S-AMP in AMP and fumarate. The pH-rate profile showed that MtASL follows an overall acid-basic mechanism of catalysis and these studies, combined with multiple sequence alignment analysis led us to propose what amino acid residues are involved in the MtASL chemical reaction. In addition, product inhibition studies and isothermal titration calorimetry of binding products allowed us to propose the MtASL kinetic mechanism. The results here reported could lead to the identification of nucleoside analogs that potently inhibit M. tuberculosis viability, with minor damages to the human host. |
