Análise bioquímica, estrutural e funcional da enzima citidina deaminase (E.C. 3.5.4.5) de Mycobacterium tuberculosis H37Rv

Abstract

The causative agent of tuberculosis (TB), Mycobacterium tuberculosis, infects one-third of the world population. The World Health Organization estimates that 8. 6 million new TB cases occurred in 2012, resulting in 1. 3 million deaths worldwide. Thus, there is a continuous need to find promising molecular targets for the development of anti-TB agents and to identify pathogenic determinants associated with M. tuberculosis virulence aiming the development of attenuated mutant strains as new vaccine candidates against TB. Enzymes involved in purine and pyrimidine biosynthesis have important roles in cellular metabolism, as they provide nucleotides that are essential components of a number of essential biomolecules. Cytidine deaminase (CDA) catalyzes the hydrolytic deamination of cytidine to uridine, and belongs to the pyrimidine salvage pathway. The CDA from M. tuberculosis (MtCDA) is a target for the development of attenuated strains of M. tuberculosis because it may be involved in mechanisms of pathogenicity such as latency. This work presents the crystal structures of MtCDA in complex with uridine (2. 4 Å resolution) and deoxyuridine (1. 9 Å resolution).Molecular dynamics (MD) simulation was performed to analyze the physically relevant motions involved in the protein–ligand recognition process, showing that structural flexibility of some residues are important to product binding. In addition, MD simulations allowed the analysis of the stability of tetrameric MtCDA structure. The role of the conserved glutamate-47 (E47) residue was evaluated by construction of five mutant proteins (E47A, E47D, E47L, E47H, and E47Q). Mutants E47A and E47H were expressed in insoluble fraction, whereas E47D, E47L and E47Q were soluble and purified by HPLC. The E47D, E47L and E47Q mutants contained 1 mol of Zn2+ per mol of protein subunit. These mutations had no effect on oligomerization state of MtCDA. Steady-state kinetic results showed that KM values for the E47D and E47Q mutants were not significantly altered, whereas there was a decrease in kcat values of 37-fold for E47D and 19-fold for E47Q mutant. No activity could be detected for E47L mutant. The crystal structure of the E47D mutant was solved by X-rays diffraction, using synchrotron light. An essential role was proposed for the g-carboxyl group of E47, and its involvement in the catalityc process. On the other hand, an important part of drug and vaccine development is the identification of gene products that are critical for bacterial growth and survival. In this way the knockout of the cdd gene was performed in order to evaluate the importance of the cdd gene for mycobacteria growth in vitro and in vivo. Our results suggest that cdd gene is not an essential gene for in vitro growth under the employed experimental conditions. Infection in mice with the knockout strain of cdd gene has shown a significant reduction in the CFU’s in lungs and spleen of the infected animals. Futher experiments are under way to confirm such findings. Finally, results from enzymatic characterization, site directed mutagenesis and gene replacement may be the starting point for a better understanding about the role of cytidine deaminase in M. tuberculosis metabolism and open up the possibility for a rational design of attenuated strain, that may be useful for future development of a new vaccine candidate against human TB.

O agente causador da tuberculose (TB), Mycobacterium tuberculosis, infecta um terço da população mundial. A Organização Mundial da Saúde estima que 8,6 milhões de novos casos de tuberculose ocorreram em 2012, resultando em 1,3 milhões de mortes no mundo. Assim, existe uma necessidade contínua de encontrar alvos moleculares promissores para o desenvolvimento de agentes anti-tuberculose e identificar determinantes de virulência associados com a patogênese de M. tuberculosis, visando a obtenção de cepas mutantes atenuadas como candidatas a novas vacinas contra a tuberculose. As enzimas envolvidas na biosíntese de purina e pirimidina têm papéis importantes no metabolismo celular, uma vez que proporcionam nucleótidos, os quais são componentes essenciais de um grande número de biomoléculas. A enzima Citidina deaminase (CDA) catalisa a desaminação hidrolítica da citidina a uridina, e faz parte da via de salvamento das pirimidinas.A CDA de M. tuberculosis (MtCDA) devido a sua não essencialidade pode ser um alvo interesante para a obtenção de cepas atenuadas para o desenvolvimento de vacinas auxotróficas contra a tuberculose, já que pode estar envolvido nos mecanismos de invasão e latência. No presente trabalho são apresentadas as estruturas cristalográficas da MtCDA em complexo com uridina (2,4 Å de resolução) e deoxiuridina (1,9 Å de resolução). Simulação da Dinâmica Molecular (MD) foi realizada com o propósito de analisar os movimentos fisicamente relevantes envolvidos no processo do reconhecimento proteína-ligante, e mostra que a flexibilidade estrutural de algumas regiões da proteína são importantes para a ligação do produto. Além disso, simulações MD permitiram a análise da estabilidade da estrutura tetramérica da MtCDA. O papel do resíduo conservado glutamato 47 (E47) foi avaliado mediante a construção de cinco proteínas mutantes (E47A, E47D, E47L, E47H, e E47Q). Os mutantes E47A e E47H foram expressos na fração insolúvel, enquanto E47D, E47L e E47Q foram expressas na fração solúvel e purificadas por cromatografia líquida de alta performance (HPLC).Os mutantes E47D, E47L e E47Q continham 1 mol de Zn2+ por mol de subunidade de proteína. Estas mutações não tiveram efeito sobre o estado de oligomerização da MtCDA. Resultados cinéticos em estado estacionário mostraram que os valores de KM para os mutantes E47D e E47Q não foram alterados significativamente, enquanto houve uma redução nos valores de kcat de 37 vezes para E47D e 19 vezes para a mutante E47Q. Não foi detectada qualquer atividade para a mutante E47L. A estrutura cristalográfica do mutante E47D foi resolvida por cristalografia de raios-X o que nos permitiu propor um papel catalítico para o grupo g-carboxila do residuo E47, sugerindo o envolvimento de um próton na catálise. Por outro lado, uma parte essencial para o desenvolvimento de novos fármacos e vacinas, é a identificação de produtos de genes que são fundamentais para o crescimento e a sobrevivência bacteriana in vitro e in vivo. Desta forma, foi realizado o nocaute do gene cdd a fim de avaliar a importância deste gene para o crescimento do bacilo em vida livre e em condições de estresse (vida intracelular). Nossos resultados sugerem que o gene cdd não é um gene essencial para o crescimento do bacilo in vitro sob as condições experimentais utilizadas. Experimentos de infecção em camundongos com a cepa nocaute do gene cdd mostraram uma significativa redução nas UFC’s determinadas no pulmão e baço dos animais infectados. Con tudo, experimentos de crescimento in vitro e infecção em camundongos estão sendo realizados a fim de confirmar os resultados obtidos. Os resultados da caracterização enzimática e substituição gênica são o ponto de partida para o melhor entendimento sobre o papel da enzima no metabolismo de nucleotídeos em M. tuberculosis, além de abrirem a possibilidade para o desenho racional de uma cepa atenuada, útil para o futuro desenvolvimento de uma nova candidata a vacina contra a tuberculose humana.