Modulação do influxo de cálcio pelo peptídeo YY (3-36) em células do hipocampo de ratos

Abstract

Peptide YY (PYY) belongs to the neuropeptide Y (NPY) family, which also includes the neuropeptide Y (NPY) and pancreatic polipeptide (PP). These substances are biologically active, constituted of 36 aminoacids, and act via G protein coupled receptors. There are four functional subtypes of NPY family receptors in humans, namely Y1, Y2, Y4, and Y5. PYY is secreted by the intestinal L cells, being present in the blood stream in two active forms capable of crossing the blood brain barrier, PYY (1-36) and its cleavage product, PYY (3-36). PYY is a selective agonist for the Y2 receptor (Y2R) and has been identified as a modulator of appetite, promoting satiety sensation in mammals. Y2R are abundant in the brain hippocampus, where these receptors inhibit excitatory synaptic transmission and glutamatergic release when activated by potassium in hippocampal slices. Besides, knockout mice for Y2R present deficits in spatial and non-spatial memory tasks, showing a role of Y2R in learning and memory. The aim of this Master’s dissertation was searching for a better understanding of the interaction of PYY (3-36) and its Y2 receptor in CNS cells. For this purpose the activity of this peptide was investigated on Ca2+ influx in hippocampal cell cultures of Wistar neonate rats. We evaluated the influence of the presence of Ca2+ in the extracellular fluid, as well as the involvement of plasma membrane voltage-dependent Ca2+ and Na+ channels, and the influence of intracellular mechanisms related to the endoplasmic reticulum (ER), such as the SERCA pump, the inositol triphosphate (IP3) receptors and the ryanodine receptors (RyRs) in the responses induced by PYY (3-36) on the modulation of the [Ca2+]i, by using blockers specific for these channels. It was observed that the increase of the cytosolic [Ca2+] evoked by PYY (3-36) in hippocampal cells is independent of Ca2+ from the extracellular environment. Using a voltage-dependent Na+ channels blocker it was possible demonstrate that PYY (3-36) action is independent on Na+, suggesting that its activity on hippocampal cells does not induce or does not depend on cellular depolarization. In the experiments using RyRs or SERCA pump blockers it was observed an elevation of Ca2+ influx, that probably occurred due to the activation of SOCC, but with the concomitant presence of the a voltage-dependent Na+ channels blocker, this effect was abolished, suggesting a probable inhibition of SOCC channels in these conditions. In the experiments in the presence of an IP3Rs inhibitor, there was a decrease in cytosolic [Ca2+] evoked by PYY (3-36). The results from our experiments indicate that the action of PYY (3-36) on Ca2+ mobilization is mediated by intracellular receptors of the ER, suggesting that the observed elevation of [Ca2+]i is modulated especially by the activation of the intracellular Ca2+ signalling cascade through IP3 receptors.

O peptídeo YY (PYY) pertence à família do neuropeptídio Y que é composta também pelo neuropeptídio Y (NPY) e pelo polipeptídio pancreático (PP). São peptídeos biologicamente ativos, compostos por 36 aminoácidos e atuam via receptores acoplados a proteína G. Existem quatro subtipos de receptores para a família do NPY que são funcionais em humanos, denominados como: Y1, Y2, Y4 e Y5. O PYY é secretado no intestino pelas células L e circula no organismo em duas formas ativas que atravessam a barreira hematoencefálica, que são o PYY (1-36) e sua forma clivada PYY (3-36). O PYY (3-36) é um agonista seletivo do receptor Y2 e tem sido evidenciado por seu papel como um modulador do apetite, promovendo a sensação de saciedade em mamíferos. O hipocampo é uma região rica em receptores Y2 e já se demonstrou que a ativação destes receptores no hipocampo pode inibir a transmissão sináptica excitatória e a liberação de glutamato estimulada por potássio em fatias hipocampais. Em camundongos knockout para o receptor Y2 observou-se déficits na memória espacial e na memória não espacial nestes animais evidenciando também seu envolvimento na regulação da função cognitiva associada com o aprendizado e memória. O desenvolvimento desta dissertação teve por objetivo buscar uma melhor compreensão da interação do PYY (3-36) e seu receptor Y2 em células do sistema nervoso central. Para isso investigou-se a atividade deste peptídeo no influxo de cálcio (Ca2+) em células cultivadas do hipocampo de ratos Wistar neonatos. Avaliou-se a influência do Ca2+ presente no meio extracelular, bem como o envolvimento dos canais de Ca2+ e Na+ voltagem dependentes presentes na membrana plasmática, e a influência de mecanismos intracelulares presentes no retículo endoplasmático (RE), como a bomba do retículo sarco/endoplasmático Ca2+- ATPase (SERCA), os receptores de inositol trifofato (IP3Rs) e os receptores de rianodina (RyRs) nas respostas induzidas pelo PYY (3-36) sobre a modulação da concentração de Ca2+ intracelular ([Ca2+]i), através da utilização de bloqueadores específicos para estes canais. Foi observado que o aumento da concentração de Ca2+ ([Ca2+]) citosólico evocado pelo PYY (3-36) em células do hipocampo é independente do Ca2+ do meio extracelular. E através da utilização de bloqueadores dos canais de Na+ voltagem dependentes conseguiu-se demonstrar que a ação do PYY (3-36) é independente do influxo de Na+, sugerindo que a sua atividade sobre as células hipocampais não induz ou independe da despolarização celular. Nos experimentos utilizando bloqueadores dos RyRs ou da bomba SERCA observou-se uma elevação do influxo de Ca2+, o que provavelmente ocorreu devido a ativação dos canais de cálcio operados por estoque (SOCC, do inglês store-operated calcium channels), porém na presença concomitante de bloqueadores de canais de Na+ voltagem dependentes, este efeito foi bloqueado, sugerindo uma provável inibição dos canais SOCC nessas condições. Finalmente, na presença de inibidores dos IP3Rs, ocorreu uma diminuição da [Ca2+] citosólico evocada pelo PYY (3-36) nas células. Os resultados evidenciam que a ação do PYY (3-36) sobre a mobilização do Ca2+ é através de receptores intracelulares do RE, sugerindo que a elevação da [Ca2+]i observada, é modulada principalmente pela ativação da cascata de sinalização do Ca2+ intracelular pelos receptores de IP3.