Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10923/9574
Type: masterThesis
Title: Purificação da enzima glucocerebrosidase humana produzida no leite do primeiro clone caprino transgênico da América Latina
Author(s): Wagner, Elisamar Santos Marin
Advisor: Santos, Diógenes Santiago
Publisher: Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul
Graduate Program: Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Farmacêutica
Issue Date: 2016
Keywords: ENZIMAS - FARMACOLOGIA
DOENÇA DE GAUCHER
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
ANIMAIS TRANSGÊNICOS
BIOTECNOLOGIA - FÁRMACOS
BIOLOGIA MOLECULAR
Abstract: Gaucher disease, first described in 1882, is a rare autosomal recessive genetic disorder characterized by a deficiency of glucocerebrosidase, an enzyme that catalyses the hydrolysis of lysosomal glucocerebroside into glucose and ceramide. The presence of two mutant alleles located on chromosome 1 q21 region confirms the diagnosis of Gaucher disease, with N370S and L444P being the most common mutations. Clinical characteristics commonly associated with Gaucher disease include hepatosplenomegaly, anemia, thrombocytopenia and bone involvement, hematological and neurological impairment in type II and III. The accumulation of mutant enzyme and subsequent depletion of normal enzyme can be treated with enzyme replacement therapy using recombinant glucocerebrosidase. Enzyme replacement therapy is quite effective in the treatment of this disease, often reversing the cascade of biochemical events that lead to clinical manifestations and improving many of the patient's signs and symptoms. There are three recombinant enzymes for enzyme replacement therapy in Gaucher disease: Velaglucerase alfa, Alfataliglucerase and Imiglucerase. These enzymes differ from each other mainly in relation to the form of production, the amino acid sequence, and the glycosylation pattern. Currently, enzyme replacement therapy is administered by a drug called Cerezyme® (imiglucerase), produced by recombinant DNA technology using cell cultures obtained from Chinese hamster ovary. The imiglucerase differs from natural glucocerebrosidase, from placental origin, by an amino acid at position 495, where histidine is replaced with arginine. However, the cost of Cerezyme® is very high, hindering access to therapy. In Brazil, there are nearly 600 carriers of the disease. Although the treatment is guaranteed by law to all patients, the expenses on the purchase of the medicine are very high. The cost could be considerably reduced if the enzyme could be produced in an alternative way. Studies have shown that advanced reproductive techniques allow transgenic animals to be used as bioreactors for production of recombinant proteins of high potential biological and pharmaceutical interest. The Molecular Biology Laboratory and the development of University of Fortaleza in partnership with Quatro G developed the first Latin America transgenic goat clone, whose mammary gland is used as a bioreactor for producing recombinant protein human glucocerebrosidase. This study presented an alternative of glucocerebrosidase enzyme purification. The alternative method was achieved by using milk obtained through an induced lactation of the transgenic and cloned goat. According to the results, one can create a positive expectation for glucocerebrosidase through the procedure cited throughout this study. The confirmation of the presence of glucocerebrosidase enzyme activity was carried out by fluorimetry test. Cerezyme® and goat’s milk control (not genetically modified) were used with positive and negative control, respectively. The objective of this study was to establish protocols for purification of glucocerebrosidase enzyme from the cloned and transgenic goat's milk and confirm the enzyme activity, to evaluate the expression of the enzyme by electrophoresis, and to characterize the recombinant protein by mass spectrometry.
A doença de Gaucher, descrita pela primeira vez em 1882, é uma rara desordem genética autossômica recessiva caracterizada pela deficiência da atividade da glucocerebrosidase, uma enzima lisossomal que catalisa a hidrólise de glucocerebrosídeo em glicose e ceramida. A presença de dois alelos mutantes localizado na região q21 do cromossomo 1 confirma o diagnóstico, sendo as mutações mais comuns são N370S e L444P. O acúmulo desta enzima pode ser tratada com terapia de reposição enzimática, usando glucocerebrosidase recombinante, bastante eficaz no tratamento da doença, revertendo toda a cascata de eventos bioquímicos que acabam por ocasionar as manifestações clínicas apresentadas pelos pacientes ou melhorando muitos dos seus sinais e sintomas. As características clínicas comumente associados com a doença de Gaucher incluem hepatoesplenomegalia, anemia, trombocitopenia e envolvimento ósseo, hematológico e comprometimento neurológico no tipo II e III. Há três enzimas recombinantes para a terapia de reposição enzimática na doença de Gaucher: Velaglucerase alfa, Alfataliglucerase e Imiglucerase que diferem entre si principalmente em relação à forma de produção, à sequência de aminoácidos e ao padrão de glicosilação. Atualmente, a terapia de reposição enzimática é administrada por um medicamento chamado Cerezyme® (imiglucerase), produzido através da tecnologia do DNA recombinante utilizando culturas de células obtidas do ovário de hamster chinês. A imiglucerase difere da glucocerebrosidase natural, de origem placentária, por um aminoácido na posição 495, onde a histidina é substituída por arginina. Entretanto, o custo do medicamento disponível é muito alto, dificultando o acesso à terapia. No Brasil, há aproximadamente 600 portadores da doença e o tratamento é garantido por lei a todos os pacientes, embora os gastos com a compra do medicamento sejam muito elevados. Este custo poderia ser consideravelmente reduzido se a enzima pudesse ser produzida de forma alternativa. Estudos demonstraram que técnicas reprodutivas avançadas permitem que animais transgênicos possam ser usados como biorreatores para a produção de proteínas recombinantes de elevado potencial biológico e interesse farmacêutico. O Laboratório de Biologia Molecular e do Desenvolvimento da Universidade de Fortaleza em parceria com a Quatro G Pesquisa e Desenvolvimento desenvolveu o primeiro clone transgênico de cabras da América Latina cuja glândula mamária é usada como um biorreator para a produção da proteína glucocerebrosidase humana recombinante. Neste presente estudo, foi apresentado uma alternativa de purificação da enzima glucocerebrosidase a partir do leite obtido através da lactação induzida da cabra transgênica e clonada. De acordo com os resultados, pode-se criar uma expectativa positiva para a obtenção da glucocerebrosidase através do procedimento citado ao longo deste estudo. A confirmação da presença de atividade enzimática de glucocerebrosidase foi realizada pelo ensaio fluorimétrico, Cerezyme® e leite da cabra controle (não transgênica) foram usados com controle positivo e negativo, respectivamente. O objetivo deste estudo foi estabelecer protocolos de purificação da enzima glucocerebrosidase a partir do leite da cabra clonada e transgênica e confirmar a atividade enzimática, avaliar a expressão da enzima por eletroforese e caracterizar a proteína recombinante através da espectrometria de massa.
URI: http://hdl.handle.net/10923/9574
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