Estudo de proteínas do tubo reprodutor de Angiostrongylus spp. para diagnóstico imunológico das angiostrongilíases

Abstract

Nematode worms in the genus Angiostrongylus are intra-arterial parasites of rodents. A. costaricensis lives in mesenteric system while A. cantonensis inhabits the pulmonary arteries. Man is an accidental host and the worm may cause eosinophilic gastroenteritis or meningitis due to migration of A. cantonensis’ young adult worms through central nervous system tissues. Molecular methods for diagnosis of human disease are important since parasitological diagnosis is prevented by lack of larval elimination in feces. Immunodiagnostic methods based on crude antigens lack both specificity and sensibility. Efforts where directed towards analysis of fractions for detection of antigens with better performance in immunodiagnosis for the improvement of molecular diagnosis of angiostrongyliasis. The possibility of heterologous antigens was also tested, A. cantonensis’ proteins being standardized in ELISA for the detection of anti-A. costaricensis’ antibodies. Analysis of fractions was initiated with the study of proteins extracted from the reproductive tract (RT) from female worms of A. cantonensis, several fraccionation protocols were tested and protein recognition by sera from infected humans was probed by Western blot (WB). Protein A immunoaffinity columns were loaded with sera from infected patients but recovery of antigens was unsuccessful. The RT extract was fractionated at sub-cellular level and the cellular membrane fraction (F2) was subsequently separated according to isoeletric point intervals. Proteins at several pH intervals were recognized by positive sera in WB. These antigens may be useful as antibody targets for the immunodiagnosis of angiostrongyliasis. Molecular cloning of relevant antigens is a desirable aim for future studies, leading to permanent sources of well-defined antigens and the reduction of the labor intensive in vivo production of these reagents.

Vermes do gênero Angiostrongylus são parasitos intra-arteriais em roedores. A. costaricensis vive no sistema mesentérico, enquanto A. cantonensis habita as artérias pulmonares de ratos. No homem, hospedeiro acidental destas parasitoses, elas causam a gastroenterite eosinofílica e meningite devido à migração de adultos jovens de A. cantonensis nos tecidos do sistema nervoso central. O exame parasitológico de fezes não pode ser utilizado para diagnóstico humano das angiostrongilíases porque não são encontradas larvas nas fezes, o que torna importante o desenvolvimento de técnicas moleculares. Os métodos de imunodiagnóstico empregando antígenos brutos apresentam reatividade cruzada com outras parasitoses e também resultados falso-negativos. Com o objetivo de aprimorar o diagnóstico molecular das angiostrongilíases, direcionamos os esforços na tentativa de reduzir a complexidade dos extratos de antígenos a fim de encontrar proteínas mais específicas e sensíveis para o diagnóstico. Primeiramente foi testado o uso de antígenos de A. cantonensis para o diagnóstico de A. costaricensis pela técnica de ELISA.A partir disso, antígenos de tubo reprodutor (TR) de fêmeas de A. cantonensis foram fracionados por diversas técnicas e sua reatividade a soros controle foi testada por Western blot (WB). Colunas de proteína A foram incubadas com soro de pacientes infectados, porém este fracionamento não teve sucesso. Foi realizado o fracionamento subcelular dos extratos TR e com a fração de antígenos de membrana celular (F2) foi realizado o fracionamento por ponto isoelétrico. As frações de pH apresentaram reatividade específica aos soros controle positivos quando submetidas ao WB, sugerindo que as proteínas encontradas possam ser importantes alvos para o diagnóstico das angiostrongilíases. A possibilidade de clonar as proteínas de interesse para produção em grande escala, poderá constituir fonte permanente de antígenos com redução do volume de trabalho e do emprego de animais no laboratório.