| Resumen: | Protein-DNA comples assembling depends on amino acid side chains and nucleotides charge complementarity (direct readout mechanism) and on recognition by the protein os an already existing or induced three-dimensional DNA conformation (indirect readout mechanism). The PDEF protein is a transcriptional factor of genes related with cancer development in tissues under sexual hormones regulation, mainly prostate and mammary epithelia. Similar to the other proteins of the ETS family, PDEF binds DNA sequences through its ETS domain, which characterizes this family of transcription factors. Experimental studies indicate that ETS proteins are more dependable on indirect readout mechanism for complex formation, where the structure adopted by the DNA double helices has greater influence on the protein blinding affinity than the nucleotide sequence. While most ETS have high affinity for the nucleotide core seqeence 5'-GGAA-3' and low affinity to 5'-GGAT-3', PDEF blinds with high affinity the core sequence 5'-GGAT-3' and did not blind 5'-GGAT-3' sequences at all. PDEF has unique amino acid substitutions on the helix that blinds DNA in the major groove. In order to evaluate these amino acid substitutions consequences and the effect of base pair replacement on ETS blinding site on DNA's three-dimensional conformation, and consequently on protein-DNA affinity, we performed bioinformatics analyses on the ETS protein sequences and protein-DNA binding pattern analyses, as well as molecular dynamics simulation of 13 base-pairs DNA sequences with PDEF's high (GGAT), low (GGAG) and null (GGAA) affinity binding site. Bioinformatics analyses and molecular dynamics simulations results indicate that the protein amino acids substitutions and the altered hydrogen bonds donor and acceptor exposed on the major groove of the DNA (direct readout mechanism), along with conformational changes induced by base pair replacement on protein binding site position +4 (indirect readout mechanism) seems to be responsible for PDEF distinct binding pattern. However, non-conserved residues that contact DNA and the greater number of unspecific protein side chain hydrogen bonds to the DNA's main chain phosphates point out to the intramolecular readout mechanism as the most important recognition mode for ETS proteins.
A formaçao dos complexos proteína—DNA depende da complementaridade de cargas entre as cadelas laterals dos aminoácidos que compöern a protelna e os nudeotIdeos que compOern a cadeia de DNA (reconhecimento direto) e do reconhecirnento da estrutura, da conformaçao tridimensional, adotada ou capaz de ser adotada pela cadeia de DNA (reconhecimento indireto). A proteína PDEF está relacionada com o controle da transcrição de genes responsáveis pelo desenvolvimento de tumores em tecidos sujeitos à regulação por hormônios sexuais; principalmente câncer de mama e de próstata. Assim como as demais proteínas da família ETS de fatores de transcrição, a PDEF reconhece e se liga à cadeia de DNA através do domínio ETS, que caracteriza esta família. As proteínas ETS apresentam maior dependência dos fatores de reconhecimento indiretos na formação dos complexos proteína - DNA. Ou seja, a conformação adotada pela cadeia de DNA tem maior influência sobre a afinidade de ligação da proteína do que a própria seqüência de nucleotídeos. Ao contrário das demais proteínas ETS, que reconhecem com alta afinidade a seqüência 5’-GGAA-3’, e apresentam baixa ou nenhuma afinidade pela seqüência 5’-GGAT-3’, a proteína PDEF apresenta alta afinidade de ligação pela seqüência 5’-GGAT-3’ e não forma complexos com cadeias de DNA que contenham o sítio de ligação 5’-GGAA-3’. A PDEF apresenta ainda substituições únicas de aminoácidos na hélice de reconhecimento da cadeia de DNA. Para avaliar os efeitos destas substituições de aminoácidos e das substituições de pares de base no sítio de ligação da proteína na conformação tridimensional da cadeia de DNA, e consequentemente, na afinidade de ligação entre proteína e DNA, foram realizadas análises das seqüências de aminoácidos das proteínas ETS e das interações observadas experimentalmente na interface proteína-DNA e simulações pela dinâmica molecular dos tridecâmeros de DNA que contêm as seqüências de alta e de baixa afinidade pela proteína PDEF (GGAT e GGAG, respectivamente) e do sistema controle sem afinidade de ligação, GGAA. Os resultados das análises e das simulações pela dinâmica molecular indicam que as alterações na seqüência de aminoácidos da proteína, e a substituição dos grupamentos expostos no sulco maior da cadeia de DNA (padrão de reconhecimento direto, ou intermolecular), aliados a alterações na conformação da cadeia de DNA induzidas pelas substituições das bases na posição +4 do sitio de ligação (padrão de reconhecimento indireto ou intramolecular) parecem ser responsáveis pelo padrão de afinidade distinto da PDEF. No entanto, a não conservação dos resíduos que interagem com a cadeia de DNA, e a grande número de contatos não específicos com a cadeia fosfato-açúcar corroboram o padrão de leitura intramolecular como o principal mecanismo de reconhecimento da cadeia de DNA pelas proteínas ETS. |
