| Abstract: | Human thymidine phosphorylase (hTP) also known as platelet-derived endothelial cell growth factor (PD-ECGF) or gliostatin, has an important role in nucleotide metabolism. hTP is a molecular target for anticancer drug development since it is overexpressed in certain solid tumours, and its catalityc activity has been shown to be essencial to promote angiogenesis. This work describes amplification, cloning, and recombinant expression in E. coli, purification to homogeinity of both precursor and mature protein hTP. Mass spectrometry analysis confirmed the identity of homogeneous hTP and size exclusion chromatography showed that hTP proteins are a dimer in solution. Kinetic studies allowed the determination of apparent and true kinetic constants for forward reaction, and showed that enzymes displayed substrate inhibition for thymidine. Initial velocity and isothermal titration calorimetry (ITC) studies suggested that hTP catalysis follows a rapid-equilibrium random bi-bi kinetic mechanism. Thermodynamics constants and discrimination profile allowed natural enzyme’s substrates/products binding patterns identification. Additionally, these studies showed differences in the kinetic constants and the thermodynamic parameters between the precursor and the mature protein and these differences were revealed by structural analysis using molecular modeling. The pH-rate profiles suggested that maximal enzyme activity was achieved at low pH values, and functional groups with a pK values of 5. 1 – 5. 2 and 9. 0 – 9. 2 are involved in thymidine binding, and groups with pK value of 6. 1 – 6. 2 and 7. 8 – 8. 6 are involved in phosphate binding. The enzyme characterization provides additional data that may be useful for the rational design of novel inhibitors hTP. Chemical compounds designed and synthesized as potential inhibitors against hTP activity were active in both forms of the enzyme, whereas the compound 5g showed the best inhibitory potential. The compound 5g was characterized as noncompetitive inhibitor towards hTP substrates thymidine and phosphate. The noncompetitive inhibiton mechanism points to the existence of an allosteric binding site at hTP, different from the substrate binding sites. This allosteric site could be considered an important molecular target for the development of potent and selective hTP inhibitors.
A Timidina fosforilase humana (hTP), também conhecida como PD-ECGF e gliostatina, é uma enzima importante no metabolismo de nucleotídeos. A hTP é um alvo molecular para o desenho de inibidores enzimáticos com possível uso na terapia do câncer, visto que essa enzima encontra-se superexpressa em alguns tipos de tumores sólidos e sua atividade catalítica é essencial para promoção da angiogênse. Esta tese descreve a amplificação, clonagem, expressão heteróloga em E. coli, purificação e caracterização bioquímica do precursor e da proteína madura hTP. Análises de espectrometria de massa confirmaram a identidade das proteínas recombinantes e ensaios de cromatografia de exclusão por tamanho revelaram que ambas as enzimas encontram-se como dímeros em solução. Estudos cinéticos permitiram a determinação das constantes cinéticas aparentes e verdadeiras para a reação direta e mostraram que as enzimas apresentam inibição pelo substrato tidimina. Estudos espectofotométricos de velocidade inicial e estudos de ligação por microcalorimetria de titutalação isotérmica (ITC) sugerem que a catálise enzimática segue um mecanismo cinético bi-bi aleatório de rápido equilíbrio. As constantes termodinâmicas e o perfil de discriminação termodinâmica permitiram a identificação dos modos de interação dos substratos/produtos naturais das enzimas com seus sítios de ligação. Além disto, esses estudos revelaram diferenças nas constantes cinéticas e nos parâmetros termodinâmicos entre o precursor e a proteína madura e tais diferenças foram evidenciadas por meio da análise estrutural de ambas as enzimas.O perfil de pH mostrou que a atividade enzimática máxima foi obtida em valores de pH baixos, e que grupamentos funcionais com valores de pK de 5,1 – 5,2 e 9,0 – 9,2 estão envolvidos na ligação à timidina e grupamentos com valores de pK de 6,1 – 6,2 e 7,8 – 8,6 estão envolvidos na ligação ao fosfato. Os resultados da caracterização da enzima fornecem dados adicionais que podem ser úteis para o desenho racional de novos inibidores da hTP. Os compostos químicos planejados e sintetizados como possíveis inibidores da atividade da hTP foram ativos em ambas as formas da enzima, sendo que o composto 5g apresentou o melhor potencial inibitório. O composto 5g foi caracterizado como um inibidor não competitivo em relação aos substratos naturais timidina e fosfato. O mecanismo de inibição não competitiva sugere a existência de um sitío de ligação alostérico na hTP, diferente dos sítios de ligação aos substratos, podendo ser considerado um alvo molecular importante para a busca de inibidores potentes e seletivos para hTP. |
