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Tipo: doctoralThesis
Título: A utilização de células-tronco mesenquimais adipogênicas e acido hialurônico como composto celular para engenharia tecidual óssea: estudo in vivo
Autor(es): Boeckel, Daniel Gonçalves
Orientador: Teixeira, Eduardo Rolim
Sesterheim, Patrícia
Editora: Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul
Programa: Programa de Pós-Graduação em Odontologia
Data de Publicação: 2016
Palavras-chave: CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS
ÁCIDO HIALURÔNICO
ENGENHARIA TECIDUAL
REGENERAÇÃO ÓSSEA
IMPLANTODONTIA
ODONTOLOGIA
Resumo: A presente pesquisa tem por objetivo caracterizar as células-tronco mesenquimais de origem adiposa (CTMAs) e avaliar seu uso sobre a matriz de ácido hialurônico (AH) como composto celular para engenharia tecidual óssea. Primeiramente, foi realizada a caracterização celular através da coleta do tecido adiposo epididimal, isolamento, cultivo e expansão in vitro. Através da análise morfológica da cultura das CTMAs foi possível confirmar característica fusiforme alongada, núcleo centralizado, prolongamentos e adesão à garrafa plástica. A análise de expansão também comprovou um alto índice proliferativo celular, durante os 26 dias de cultura in vitro. Já o teste de citometria de fluxo permitiu a identificação dos principais marcadores de superfície que caracterizam as células-tronco mesenquimais (CD29 e CD90) e sendo negativo para marcadores hematopoiéticos (CD31 e CD45). As CTMAS também quando induzidas aos meios adipogênico e osteogênico mostraram plasticidade, já que foram capazes de diferenciarem-se em adipócitos e osteoblastos, respectivamente. Ainda in vitro, foi realizado o teste de viabilidade celular através do MTT (atividade mitocondrial), após o contato das CTMAs sobre a matriz de AH. As concentrações de 100%, 75%, 50%, 25% e 15% foram avaliadas sobre a matriz de AH nos tempos de 24, 48 e 72 horas. Os resultados comprovaram uma viabilidade celular acima de 60% em quase todos os tempos e concentrações. Em seguida, foram realizados 50 defeitos ósseos críticos (DOC) na região femoral com 2 mm de diâmetro (um defeito por fêmur) em 25 ratos Lewis. Os tratamentos de enxertia realizados foram divididos da seguinte forma: I-controle negativo / apenas o defeito (C); II- matriz AH; III-CTMAs; IV-CTMAs + AH e V- CTMAs osteoinduzida + AH.Após 23 dias os ratos sofreram eutanásia e tiveram 5 fêmures utilizados para as análises microtomográficas (μ-CT) e histomorfométrica e 5 fêmures utilizados para a análise por RT-PCR (Reação em cadeia da Polimerase em tempo Real). Os resultados para os testes por μ-CT no parâmetro volume de tecido ósseo (VTO) e porcentagem de tecido ósseo (PTO) não apresentaram diferenças estatísticas entre todos os grupos. Já, nos parâmetros superfície de contato (SCO) e densidade de superfície óssea (DSO) tivemos o grupo IV, III e V com maiores índices e diferindo estatisticamente dos grupos controle negativo I e do grupo II. Na histomorfometria também tivemos os grupos IV, V e III com maiores áreas de tecido ósseo regenerado e diferindo com significância dos grupos I e II. Os resultados foram analisados estatisticamente pela Análise de Variância de uma via (ANOVA) o nível de significância estabelecido foi de 5% (p < 0,05). Em relação ao RT-PCR, observou-se diferença estatisticamente significante apenas quando foi avaliada osteonectina (ON), sendo que o grupo II e V apresentaram maior expressão em relação aos grupos III e IV. Em relação à osteopontina (OP) e ao colágeno Tipo I (Col1A) não foram identificadas diferenças entres os grupos tratados. Os resultados foram analisados através do teste não paramétrico de Kruskal-Wallis e o nível de significância estabelecido foi de 5% (p < 0,05).
The present research aims to characterize the mesenchymal stem cells of adipose origin (MSCAs) and to evaluate its use on the scaffold of hyaluronic acid (HA) as a cellular compound for bone tissue engineering. Firstly, cell characterization was performed through the collection of epididymal adipose tissue, isolation, culture and in vitro expansion. Through the morphological analysis of MSCAs culture it was possible to confirm elongated fusiform characteristic, centralized nucleus, extensions and adhesion to the plastic bottle. Expansion analysis also demonstrated a high cell proliferative index during the 26 days of in vitro culture. The Flow Cytometry test allowed the identification of the main surface markers that characterize the mesenchymal stem cells (CD29 and CD90) and negative for hematopoietic markers (CD31 and CD45). Moreover, MSCAs when induced to adipogenic and osteogenic media showed plasticity, since they were able to differentiate into adipocytes and osteoblasts respectively. The cell viability test was also performed in vitro, through the M.T.T (mitochondrial activity) of MSCAs on the HA scaffold. Concentrations of 100%, 75%, 50%, 25% and 15% were evaluated on the HA scaffold at times of 24, 48 and 72 hours. The results have shown cellular viability above 60% in almost all times and concentrations. Then, 50 critical bone defects were performed in the femoral region with 2 mm in diameter (one defect per femur) in 25 Lewis rats. The grafting treatments were divided as follows: I-negative control / only the defect (C); II-HA Scaffold; III- MSCAs; IV- MSCAs + HA and V- MSCAs previously osteoinduced + HA.After 23 days the rats were euthanized and had 5 femurs used for the microtomographic (μ-CT) and histomorphometric analysis and 5 femurs used for the RT-PCR (Real-Time Polymerase Chain Reaction) analysis. The results for the μ-CT tests in the volume of osseous tissue parameter (VOT) and the percentage of osseous tissue (POT) did not present statistical differences among all groups. However, on the osseous contact surface (SCO) and osseous surface density (DSO) parameters, we had groups IV, III and V with higher indexes and differing statistically from the negative control groups I and group II. In histomorphometry we also had groups IV, V and III with greater area of regenerated bone tissue and differing with significance from groups I and II. The results were analyzed statistically by Analysis of Variance one way (ANOVA) and the level of significance was 5% (p <0.05). Regarding RT-PCR, a statistically significant difference was observed only when we evaluated osteonectin (ON) in which group II and V were more expressive in relation to groups III and IV. Regarding osteopontin (OP) and Type I collagen (Col1A), no differences were identified among the treated groups. The results were analyzed using Kruskal-Wallis non-parametric test and the significance level set was 5% (p <0.05).
URI: http://hdl.handle.net/10923/10402
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