Redes extracelulares de DNA de células granulocíticas no escarro de crianças com asma

Abstract

Base teórica: a asma é uma doença heterogênea, caracterizada pela inflamação crônica das vias aéreas inferiores. O processo inflamatório está associado à hiper-responsividade brônquica, tendo como consequência, episódios recorrentes de sibilância, tosse, dispneia e opressão torácica. A doença atinge em torno de 300 milhões de pessoas no mundo, sendo considerada uma doença com elevada prevalência, principalmente na população infantil. A inflamação crônica presente nas vias aéreas de indivíduos com asma é complexa e envolve um conjunto de células provenientes do sistema imunológico, incluindo linfócitos T, granulócitos, células epiteliais, entre outras. Os granulócitos são considerados células fundamentais para sustentar a inflamação. Os neutrófilos e os eosinófilos apresentam características e funções diferentes para a resposta imune na asma. Ambos liberam uma variedade de mediadores que contribuem para inflamação crônica e alterações na estrutura das vias aéreas, com estímulos externos. Neste contexto, foi demonstrado que os neutrófilos e eosinófilos, após ativação, são capazes de liberar “armadilhas” de DNA extracelular com proteínas específicas, que combatem agentes patogênicos extracelularmente. Por outro lado, é possível que essas “armadilhas” de DNA contribuam para a imunopatologia em doenças inflamatórias crônicas, como na asma. Portanto, recentemente, foi identificado que neutrófilos e eosinófilos geram redes extracelulares de DNA nas vias aéreas de asmáticos adultos. Objetivo: verificar se existe formação de redes extracelulares de DNA com a presença de células inflamatórias em amostra de escarro de crianças e adolescentes com asma.Métodos: nosso estudo transversal selecionou crianças e adolescentes com asma, entre 6 e 18 anos de idade, em acompanhamento regular em um centro de referência do sul do Brasil. Foram coletados dados relativos a função pulmonar (espirometria), teste cutâneo para alérgenos, e escarro induzido para identificação do perfil de células inflamatórias, formação das redes extracelulares de DNA, e quantificação do DNA extracelular. Para a visualização das redes extracelulares de DNA, as células foram coradas com Hoechst 33342. As imagens foram capturadas em microscópio confocal de fluorescência. Resultados: foram incluídos 18 crianças e adolescentes, sendo 13 com asma grave e 5 não grave. Destes, 17 (94,4%) obtiveram o teste cutâneo positivo para algum tipo de alérgenos e todos apresentaram função pulmonar dentro dos limites da normalidade. Os pacientes com perfil de células inflamatórias (7,12 [4,41-45,23]) obtiveram um aumento significativo (p=0,01) nas concentrações extracelulares de DNA quando comparados com pacientes com perfil pauci-granulocítico (2,31[1,47-3,56]). Os níveis de DNA extracelular correlacionaram-se positivamente (r=0,73; p=0, 0004) com as células granulocíticas totais no escarro destes pacientes. Do mesmo modo, houve uma correlação positiva entre o DNA extracelular com a contagem absoluta de neutrófilos (r=0,71; p=0,008) e contagem absoluta de eosinófilos (r=0,69; p=0,0013) nas amostras de escarro. Conclusão: nossos resultados mostram a presença de redes extracelulares de DNA no escarro com padrão inflamatório em crianças e adolescentes com asma sugerindo que estas redes são liberadas por células granulocíticas, especificamente neutrófilos e eosinófilos.

Background: asthma is a heterogeneous disease characterized by chronic inflammation of the lower airways. The inflammatory process is associated with bronchial hyperresponsiveness, resulting in recurrent episodes of wheezing, coughing, dyspnea and chest tightness. Asthma affects around 300 million people worldwide, with high prevalence, mainly in children. Chronic inflammation in the airways of patients with asthma is complex and involves a range of cells from the immune system, including T lymphocytes, granulocytes, epithelial cells, among others. Granulocytes are considered key cells to maintain inflammation. Neutrophils and eosinophils have different characteristics and functions for the immune response in asthma. Both type of cells release a variety of mediators that contribute to chronic inflammation and changes in the structure of the airways, secondary to external agents. In this context, it was demonstrated that after activation neutrophils and eosinophils are able to release extracellular DNA "traps" with specific proteins that kill extracellular pathogens. On the other hand, it is possible that these DNA "traps" contribute to immunopathology in chronic inflammatory diseases, such as asthma. Therefore, it has recently been shown that neutrophils and eosinophils generate extracellular DNA traps in the airways of asthmatics, possibly contributing to tissue damage. Objective: to verify whether there is extracellular DNA traps and the presence of inflammatory cells in sputum samples of children and adolescents with asthma. Methods: this cross-sectional study selected children and adolescents with asthma, between 6 and 18 years of age, in a regular follow-up at a reference center from southern Brazil. We have performed lung function (spirometry), allergen skin test, and induced sputum to identify the inflammatory cells profile, formation of extracellular DNA traps, and quantification of extracellular DNA.To visualize the extracellular DNA traps, the cells were stained with Hoechst 33342. The images were captured on a fluorescence confocal microscope. Results: 18 children and adolescents were included, 13 with severe asthma and 5 with non-severe asthma. Of these, 17 (94.4%) had a positive skin test for some type of allergens and all patients presented pulmonary function within the limits of normality. Patients with inflammatory cell profiles in sputum (7,12 [4,41,45,23]) showed a significant increase (p = 0.01) in extracellular DNA concentrations compared to patients with pauci-granulocytic profile (2.31 [1.47-3.56]). The extracellular DNA levels correlated positively (r = 0.73, p = 0.004) with the total granulocytic cells in the sputum of these patients. Likewise, there was a significant positive correlation between extracellular DNA and absolute sputum neutrophil counts (r = 0.71, p = 0.008) and absolute sputum eosinophils counts (r = 0.69; p = 0.0013) in the sputum samples. Conclusion: Our results show the presence of extracellular DNA traps in sputum with inflammatory pattern of children and adolescents with asthma suggesting that these traps are released by granulocytic cells, specifically neutrophils and eosinophils.