Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10923/10797
Type: doctoralThesis
Title: Avaliação do fenótipo de persistência em isolados nosocomiais de Acinetobacter calcoaceticus-baumannii
Author(s): Gallo, Stephanie Wagner
Advisor: Oliveira, Silvia Dias de
Ferreira, Carlos Alexandre Sanchez
Publisher: Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul
Graduate Program: Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Issue Date: 2017
Keywords: CÉLULAS
INFECÇÃO
BIOFILMES
BIOLOGIA CELULAR
BIOLOGIA MOLECULAR
Abstract: Os patógenos pertencentes ao complexo Acinetobacter calcoaceticus-baumannii (ACB) são considerados oportunistas e emergentes, responsáveis por ocasionar diversas enfermidades, acometendo principalmente pacientes imunocomprometidos e internados em unidades de tratamento intensivo. As opções terapêuticas para o tratamento de infecções ocasionadas por estes patógenos são restritas, uma vez que estes apresentam frequentemente resistência à maioria dos antimicrobianos. Além disso, essas bactérias podem ainda formar células persisters, que constituem uma pequena população de células suscetíveis capazes de tolerar concentrações letais de antimicrobianos bactericidas e outros agentes estressores. Este fenótipo está associado a falhas na terapia antimicrobiana, especialmente nas infecções crônicas e recorrentes. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a presença de células persisters formadas por isolados do complexo ACB frente à exposição ao meropenem e/ou à polimixina B, na condição de biofilme e em cultivo planctônico, assim como analisar estas células morfologicamente e identificar padrões de expressão de proteínas que pudessem estar envolvidos na formação e manutenção da persistência. Para tanto, 20 isolados clínicos foram caracterizados quanto à capacidade em formar biofilme em superfície de poliestireno, e à suscetibilidade ao meropenem e à polimixina B, que foi avaliada por meio da determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) a estes fármacos. Todos os isolados foram submetidos à exposição ao meropenem em diferentes concentrações acima da CIM, enquanto que cinco foram expostos à polimixina B para a avaliação da presença de células persisters. Para todos os experimentos, a fim de estimar a fração de células remanescentes, alíquotas foram removidas em tempos determinados, efetuando-se diluições decimais seriadas e semeadura pela técnica da gota em ágar nutriente.Células persisters, em diferentes frações, foram encontradas nos cultivos de todos os isolados, tanto em biofilmes como na condição planctônica, após a exposição por 48 h ao meropenem e à polimixina B, sendo as frações mais elevadas encontradas na condição de biofilme para ambos os antimicrobianos. As diferentes concentrações de meropenem avaliadas não influenciaram os níveis de células persisters; entretanto, frente à exposição à polimixina B, a fração de células mostrou-se dependente da concentração empregada. Após exposição à polimixina B por 24 h, foi observada retomada de crescimento das células sobreviventes, que foram avaliadas novamente quanto à suscetibilidade a este antimicrobiano, mantendo-se suscetíveis com CIM de 1 μg/mL, bem como foi verificada a integridade do antimicrobiano no sobrenadante destes cultivos por ensaios cromatográficos, demonstrando que o mesmo não sofre degradação após 48 h de exposição. Entretanto, quando se associou meropenem à polimixina B em diferentes concentrações, além de não ter sido observada a retomada de crescimento das células remanescentes, ocorreu a erradicação das células persisters de um isolado de A. baumannii (Acb-1) cultivado em fase exponencial tardia. Além disso, a técnica de Nano-Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de Massas em Tandem foi empregada para a identificação e quantificação relativa de proteínas possivelmente associadas à persistência em A. baumannii, após a exposição ao meropenem. Diferentes padrões de expressão foram identificados entre as células persisters presentes em cultivo planctônico e em biofilme, sugerindo que a regulação da persistência possa ser realizada por mecanismos diferentes.Observou-se expressão aumentada de proteínas envolvidas nos processos de divisão celular e replicação de DNA, especialmente no cultivo planctônico, em concordância com a presença de divisão celular observada nas imagens obtidas a partir da microscopia eletrônica de varredura nesta condição de cultivo. O aumento de expressão da glicose desidrogenase (GDH), NADH desidrogenase (NDH-1), succinato desidrogenase e ATP sintase indicam a transferência de elétrons a partir da reação catalisada por GDH para a cadeia de transporte de elétrons como uma possível fonte de energética para as persisters, corroborando a observação da presença de divisão celular observada no cultivo planctônico. Em contraste, proteínas envolvidas no metabolismo de aminoácidos, bem como os principais fatores de elongação apresentaram expressão diminuída em células persisters de Acb-1, sugerindo que a síntese proteica esteja reduzida, mesmo que muitas proteínas tenham sido identificadas com expressão aumentada. Muitas proteínas relacionadas à membrana apresentaram a sua expressão aumentada, indicando possíveis alterações em sua composição e função, embora proteínas relacionadas ao metabolismo de lipídeos tenham apresentado expressão diminuída. A análise proteômica das células persisters, sobretudo, mostrou que estas células podem ser fisiologicamente distintas quando cultivadas em condições diferentes, bem como ao longo do tempo em uma mesma condição. Desta forma, considerando os distintos comportamentos do Acb-1 quando exposto isoladamente ao meropenem ou à polimixina B, bem como quando exposto a estes fármacos ao mesmo tempo, pode-se concluir que cada antimicrobiano pode ter atuado como um diferente estressor, possivelmente, levando a e/ou selecionando mecanismos de tolerância diferentes entre as persisters, o que possibilitou a sua erradicação quando os fármacos foram combinados.
Acinetobacter calcoaceticus-baumannii (ACB) complex comprises opportunistic and emerging pathogens that are responsible for several diseases, mainly affecting immunocompromised patients and those hospitalized in intensive care units. Therapeutic options for ACB infections are restricted, since these microorganisms are often resistant to most antimicrobials. In addition, these bacteria may also form persister cells, which constitute a small population of susceptible cells able to survive lethal concentrations of bactericidal antimicrobials and other stressors. This phenotype is associated with failure in antimicrobial therapy, especially in chronic and recurrent infections. Therefore, the aim of this study was to evaluate the presence of persister cells from ACB complex isolates exposed to meropenem and/or polymyxin B, in biofilm and planktonic cells, as well as to analyze these cells regarding their morphology and identify expression patterns of proteins possibly involved in the formation and maintenance of persistence. For this, 20 clinical isolates were characterized for the ability to form biofilm on polystyrene surface, and for meropenem and polymyxin B susceptibility, by the assessment of Minimum Inhibitory Concentration (MIC). All isolates were exposed to meropenem at different concentrations above the MIC, while five isolates were exposed to polymyxin B for the assessment of the persisters presence. For all experiments, in order to estimate the fraction of remaining cells, aliquots were removed at determined time points, followed by serial decimal dilutions and drop plating technique on nutrient agar. All isolates presented persisters at different proportions, in both culture conditions when exposed to meropenem or polymyxin B after 48 h. The higher fractions were verified in biofilm for both antimicrobials in comparison with planktonic cultures. Meropenem concentrations did not influence persisters levels.However, after polymyxin B exposure, persister cells fractions were dependent on the concentration employed. After 24 h polymyxin B exposure, a growth resumption of surviving cells was observed. These cells were again evaluated for susceptibility to this antimicrobial, remaining susceptible with MIC of 1 μg/ mL. Moreover, integrity of polymyxin B in the supernatant of the cultures was verified by chromatographic assay, demonstrating that polymyxin B is not significantly degraded after 48 h exposure. On the other hand, when meropenem and polymyxin B were associated at different concentrations, no resumption of cell growth was observed, as well as this combination was able to eradicate persister cells from A. baumannii (Acb-1) cultured in late exponential phase. Furthermore, Nano-Liquid Chromatography Coupled to Tandem Mass Spectrometry was employed for the identification and relative quantification of proteins possibly associated with persistence in A. baumannii, after exposure to meropenem. Different patterns of expression were identified between persister cells present in planktonic and biofilm cultures, suggesting that persistence may be regulated by different mechanisms. Proteins involved in the cell division and DNA replication were overexpressed in planktonic persisters, in agreement with the electron scanning microscopy images that presented dividing cells in this culture condition. Overexpression of glucose dehydrogenase (GDH), NADH dehydrogenase 1 (NDH-1), succinate dehydrogenase and ATP synthase indicates the electron transfer from the GDH-catalyzed reaction to the electron transport chain as a possible energy source for persisters, supporting the presence of cell division observed in planktonic culture.Conversely, proteins involved in amino acid metabolism, as well as major elongation factors were underexpressed in Acb-1 persister cells, suggesting that protein synthesis is reduced, even though many proteins were overproduced. Increased expression of several membrane-related proteins has also been observed, indicating possible changes in its composition and function, although proteins related to lipid metabolism were underexpressed. Overall, proteomic analysis of the persister cells showed that these cells could be physiologically distinct when cultured under different conditions, as well as overtime in the same condition. Therefore, considering the different behaviors of Acb-1 when exposed alone to meropenem or polymyxin B, as well as when exposed to these drugs in combination, it was concluded that each antimicrobial might act as a different stressor, possibly leading and/or selecting distinct tolerance mechanisms among persisters, which enabled their eradication when the drugs were combined.
URI: http://hdl.handle.net/10923/10797
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