| Abstract: | O Rhipicephalus microplus é um carrapato que infesta preferencialmente bovinos, causando
um grande prejuízo à pecuária. O principal método de controle é o uso de acaricidas, os quais
selecionam populações resistentes, além de aumentar o custo e o risco de contaminação da
carne, do leite e do ambiente. Desta forma, antígenos vacinais têm sido identificados e
caracterizados como alternativa aos acaricidas. Moléculas salivares de parasitos hematófagos
podem inibir respostas associadas à homeostase e modular o sistema imune do hospedeiro e,
portanto, são opções na busca por vacinas anti-carrapato. Neste contexto, este trabalho
caracterizou uma proteína rica em glicinas e a paramiosina do R. microplus. Proteínas ricas
em glicinas são secretadas na saliva e são essenciais na fixação e na alimentação do parasito.
Já a paramiosina é capaz de evadir o sistema imune do hospedeiro e mostrou-se um
importante alergeno em ácaros e antígeno vacinal contra helmintos. As sequências de cDNA e
aminoácidos da proteína rica em glicinas de R. microplus (RmPRG) foram identificadas e
analisadas, revelando duas porções distintas da proteína (com glicinas isoladas ao longo da
região N-terminal e padrões repetidos contendo glicinas ao longo da região C-terminal). A
clonagem, expressão e purificação da RmGRP foram realizadas e a proteína recombinante foi
testada quanto ao reconhecimento por soros de bovinos naturalmente e experimentalmente
infestados, indicando a sua antigenicidade, mas também uma alta heterogeneidade no
reconhecimento da proteína entre indivíduos e entre infestações no mesmo indivíduo. Além
disso, a RmGRP recombinante foi reconhecida pelos soros de coelhos imunizados com saliva
e glândula salivar de fêmeas parcialmente e totalmente ingurgitadas e ovos, mas não por soros
de coelhos imunizados com intestino. A expressão do gene codificante para a RmGRP
(rmgrp) em diferentes tecidos de fêmeas e fases do desenvolvimento do carrapato foi avaliada
por qRT-PCR. A transcrição do gene foi encontrada em ovos, larvas, machos adultos, além de
glândulas salivares, corpos gordurosos e ovários de fêmeas parcialmente e totalmente
ingurgitadas, apresentando os maiores níveis de expressão nas larvas de 1 dia e nas glândulas
salivares de fêmeas totalmente ingurgitadas. rmgrp não foi expresso nos ovos de 3 e 6 dias e
no intestino de fêmeas parcialmente e totalmente ingurgitadas, corroborando o resultado
anterior. Ainda foram avaliados os efeitos do silenciamento do RNAm correspondente à
RmGRP e à RmPRM, o que resultou na redução da taxa de postura de ovos no grupo em que
o gene da RmPRM foi silenciado e da eclosão de larvas em fêmeas tratadas nos dois grupos.
Portanto, sugere-se que as duas proteínas são importantes durante o desenvolvimento larval,
mas só a RmPRM seja necessária na formação e/ou postura dos ovos. Também foi realizada a
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clonagem da região codificante e expressão dos fragmentos N-terminal, interno e C-terminal
da paramiosina de R. microplus (RmPRM) em E. coli e da RmPRM completa em P. pastoris,
sendo confirmadas por SDS-PAGE e western-blot. A partir dos dados obtidos, ambas
RmGRP e RmPRM apresentam características que fazem delas possíveis candidatas a
comporem uma vacina coquetel contra o R. microplus.
Rhipicephalus microplus is a tick that infests preferably bovines and cause a great damage in the livestock. The main control method against ticks is the use of acaricides, which lead to the emergence of resistant populations, in addition to increasing costs and risk of contamination of meat, milk and environment. Thus, vaccine antigens have been identified and characterized as an alternative to acaricides. Salivary molecules of hematophagous parasites can inhibit responses associated to homeostasis and modulate the host immune system and, therefore, are options in the search for anti-tick vaccines. This work characterized a glycine rich-protein and the paramyosin of R. microplus. Glycine rich-proteins are secreted in tick saliva and are essential in the attachment and blood feeding. Paramyosin is able to evade the host immune system and proved to be an important allergen of mites and vaccine antigen against helminths.
The cDNA and amino acid sequences of the R. microplus glycine rich-protein (RmGRP) were identified and analyzed, revealing two distinct portions of the protein (glycine residues
presented dispersed in the N-terminal region and in repeated patterns along the C-terminal
region). Cloning, expression and purification of RmGRP were performed and the recombinant protein was tested for recognition by sera from naturally and experimentally infested bovines, indicating their antigenicity, but also displaying a high heterogeneity in protein recognition between individuals and among infestations in the same individual. In addition, recombinant RmGRP was recognized by sera from rabbits immunized with saliva and salivary gland from partially and fully engorged females and eggs, but not from sera from rabbits immunized with gut. Expression of the gene encoding RmGRP (rmgrp) in different female tissues and tick development stages was evaluated by qRT-PCR. Gene transcription was found in eggs, larvae, adult males, salivary glands, fat bodies and ovaries of partially and fully engorged females, with the highest expression levels in 1-day-old larvae and salivary glands of fully engorged females. rmgrp was not expressed in 3- and 6-day-old eggs and in guts of partially and fully engorged females, corroborating to the aforementioned result. Effects of RNAm silencing corresponding to RmGRP and RmPRM were evaluated, which resulted in egg laying reduction in the group in which the RmPRM gene was silenced and in the reduction of larval hatching rate in the two groups. Therefore, it is suggested that both proteins are important during larval development, but only RmPRM is required in egg formation and/or laying. Cloning of the coding DNA regions and expression of N-terminal, internal and Cterminal fragments of R. microplus paramyosin (RmPRM) in Escherichia coli and of the complete RmPRM in Pichia pastoris were confirmed by SDS-PAGE and western-blot. From the data obtained, both RmGRP and RmPRM have characteristics that make them possible candidates to compose a cocktail vaccine against R. microplus. |
