Estudos bioquímicos e nocaute gênico da enzima uracil fosforribosil transferase de Mycobacterium tuberculosis como alvo para o desenvolvimento de cepas atenuadas

Abstract

Tuberculosis (TB) is an infectious disease mainly caused by Mycobacterium tuberculosis, which currently infects one-third of the world’s population. Despite the availability of the Bacille Calmette-Guérin vaccine and effective short-course chemotherapy, the increasing global burden of TB has been linked to the co-infection with HIV, the emergence of multi, extensively and now totally drug-resistant strains. Furthermore, the capacity of M. tuberculosis to remain viable within infected hosts in a long-term asymptomatic infection is an additional problem for the control of TB. Nucleotides biosynthesis pathways provide promising molecular targets for the development of new vaccines and therapeutic strategies to control the global incidence of TB. Uracil phosphoribosyltransferase (UPRT) catalyzes the conversion of uracil and 5'-phosphoribosyl-a- 1'-pyrophosphate (PRPP) to uridine 5'-monophosphate (UMP) and pyrophosphate (PPi). UPRT plays an important role in the pyrimidine salvage pathway since its product (UMP) is a common precursor of all pyrimidine nucleotides. This work presents cloning, recombinant expression in Escherichia coli, and purification of the upp-encoded M. tuberculosis UPRT (MtUPRT). Mass spectrometry analysis and N-terminal amino acid sequencing confirmed the identity of homogeneous MtUPRT. The molecular mass of the native MtUPRT was shown to follow a monomer-tetramer association model by analytical ultracentrifugation. This enzyme did not show a pronounced regulation by GTP as this nucleotide did not affect enzyme kinetic parameters, and its binding was not detected by isothermal titration calorimetry (ITC).Initial velocity and ITC studies suggested that catalysis proceeds through a sequential ordered mechanism, in which PRPP binds first, followed by uracil binding, and PPi is the first product to be released, followed by UMP. ITC also showed that PRPP and UMP binding are thermodynamically favorable processes. The pH-rate profiles indicated that groups with pK values of 5. 7 and 8. 1 are important for catalytic activity and a group with a pK value of 9. 45 is involved in PRPP binding. Pre-steady-state kinetic data suggested that product release is not the rate-limiting step of the reaction catalyzed by MtUPRT. Kinetic fluorescence studies demonstrated two forms of enzyme in solution of which only one can bind to PRPP. Knockout of the upp gene showed that this gene is not essential for M. tuberculosis H37Rv in the employed experimental conditions and the absence of upp gene did not affect the mycobacterium growth. UPRT is expressed in both high and low oxygen conditions of M. tuberculosis H37Ra growth. MtUPRT is inhibited by an active metabolite of isoxyl, which does not seem to inhibit RNA polymerase, adenine phosphoribosyltransferase and hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase. Minimum inhibitory concentration of isoxyl for M. tuberculosis mutant for upp gene, complemented and wild type strains was 12. 8 μg/mL, meaning that the absence of the upp gene did not affect M. tuberculosis sensitivity to isoxyl. Altogether, these data may be useful for a better understanding about the nucleotide biosynthesis pathway in M. tuberculosis and as a framework on which to base efforts towards the development of efficient prophylactic and therapeutic strategies to decrease the global incidence of this pathogen.

A tuberculose (TB) é uma doença infecciosa causada principalmente pelo Mycobacterium tuberculosis, o qual atualmente infecta um terço da população mundial. Apesar da disponibilidade da vacina Bacille Calmette-Guérin e da eficaz quimioterapia de curta duração, o aumento na incidência global da TB está relacionado à co-infecção com o HIV e ao surgimento de cepas multi, extensivamente e agora totalmente resistente a drogas. Além disto, a capacidade do M. tuberculosis de permanecer viável dentro do hospedeiro infectado por longo período em uma infecção assintomática é um problema adicional para o controle da TB. As rotas de biossíntese de nucleotídeos fornecem alvos moleculares promissores para o desenvolvimento de novas vacinas e estratégias terapêuticas para controlar a incidência global de TB no mundo. A uracil fosforribosil transferase (UPRT) catalisa a conversão de uracil e 5’- fosforribosil-a-1’-pirofosfato (PRPP) a uridina 5’-monofosfato (UMP) e pirofosfato (PPi). A UPRT tem um papel importante na rota de salvamento das pirimidinas já que seu produto (UMP) é o precursor comum de todos os nucleotídeos pirimídicos. Este trabalho apresenta a clonagem, expressão recombinante em E. coli, e a purificação da UPRT de M. tuberculosis codificada pelo gene upp (MtUPRT). Adicionalmente, foram realizadas análises de espectrometria de massas e sequenciamento N-terminal que confirmaram a identidade da MtUPRT homogênea. A massa molecular da MtUPRT nativa seguiu um modelo de associação monômero-tetrâmero por ultracentrifugação analítica. Esta enzima não mostrou uma regulação pronunciada por GTP já que este nucleotídeo não afetou os parâmetros cinéticos da enzima, e a sua ligação não foi detectada por calorimetria de titulação isotérmica (ITC).A velocidade inicial e os estudos de ITC sugeriram que a catálise procede através de um mecanismo ordenado sequencial, no qual o PRPP liga primeiramente, seguido pela ligação de uracil, e PPi é o primeiro produto a ser liberado, seguido pelo UMP. ITC também mostrou que a ligação de PRPP e UMP são processos termodinamicamente favoráveis. O perfil de pH indicou que grupamentos com os valores de pK próximos de 5,7 e 8,1 são importantes para a atividade catalítica e um grupamento com valor de pK próximo a 9,45 está envolvido na ligação do PRPP. Dados de cinética no estado pré-estacionário sugeriram que a liberação de produto não é a etapa limitante da reação catalisada pela MtUPRT. Estudos de fluorescência demonstraram a existência de duas formas da enzima em solução, das quais apenas uma pode ligar ao PRPP. O nocaute do gene upp demonstrou que este gene não é essencial para o M. tuberculosis H37Rv nas condições empregadas no experimento e a ausência do gene upp não afetou o crescimento micobacteriano. A UPRT mostrou ser expressa tanto em altas como em baixas concentrações de oxigênio. A MtUPRT foi inibida por um metabólito ativo do isoxyl, que não parece inibir as enzimas RNA polimerase, adenina fosforribosil transferase e hipoxantinaguanina fosforribosil transferase. A concentração inibitória mínima de isoxyl para as cepas de M. tuberculosis mutante para o gene upp, complementada e tipo selvagem foi de 12,8 μg/mL, o que significa que a ausência do gene upp não afetou a sensibilidade do M. tuberculosis ao isoxyl. Assim, estes dados podem ser úteis para um melhor entendimento sobre a via de biossíntese de nucleotídeos em M. tuberculosis e podem servir como base para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas e preventivas eficientes para diminuir a incidência global deste patógeno.