A enzima histidinol desidrogenase de mycobacterium tuberculosis como alvo para o desenvolvimento de drogas: caracterização bioquímica

Abstract

Em 2009 a tuberculose (TB) foi responsável por 1,3 milhões de mortes no mundo inteiro. A incidência de casos chegou ao patamar de 9,4 milhões e as estimativas da Organização Mundial da Saúde (OMS) indicam que aproximadamente 1/3 da população mundial está infectada pelo Mycobacterium tuberculosis, principal agente causador da doença. A falta de novas drogas no mercado, o tratamento longo e com efeitos colaterais (levando ao abandono por parte dos pacientes) e os quadros de co-infecção com HIV tem colaborado para o surgimento de novas cepas resistentes as drogas atualmente em uso (MDR-TB e XDR-TB). Fica claro, portanto, que o desenvolvimento de novas drogas para o combate da TB é necessário e fundamental para que se tenha sucesso na erradicação desta doença. A via de biossíntese de histidina aparece nesse contexto oferecendo alvos atrativos, visto que está presente em organismos procarióticos, em organismos eucarióticos inferiores e em plantas, mas ausente em animais. A última enzima pertencente à via é chamada de Histidinol Desidrogenase e é responsável pela conversão de L-Histidinol em L-Histidina.Sua essencialidade para a viabilidade do bacilo foi comprovada através de nocaute gênico, confirmando sua potencialidade para o desenvolvimento de compostos inibidores de sua atividade. Neste trabalho, um protocolo depurificação foi desenvolvido, produzindo a enzima na forma homogênea em quantidades suficientes para realizar a caracterização bioquímica da mesma. A enzima necessita de um íon metálico divalente no sítio para catalisar a reação. Suas constantes cinéticas foram determinadas, assim como o mecanismo, os perfis de pH, e a interação com os substratos e produtos através de calorimetria de titulação isotérmica. Um modelo tridimensional da sua estrutura foi construído por homologia de sequência, permitindo uma análise da interação dos substratos e do metal no sítio ativo da enzima. Os resultados obtidos permitirão o desenho racional de moléculas que atuem como inibidores.

In 2009, tuberculosis (TB) was responsible for 1.3 million deaths worldwide. The incidence rates reached 9.4 millions and the World Health Organization (WHO) estimative indicates that one third of the world population is infected by Mycobacterium tuberculosis, the main agent responsible for the disease. The lack of new drugs released on market, the long period treatment presenting side effects (causing the abandon by the patients) and the cases with HIV co-infection contributed to the appearance of multi drug resistant strains (MDR-TB) and extensively drug resistant strains (XDR-TB). It's clear, thus, that the development of new drugs to fight TB is necessary and fundamental to the success in eradicating this disease. The histidine biosynthesis pathway emerge in this context offering attractive targets, given that its present in prokaryotes, lower eukaryotes and plants, but absent in animals. The last enzyme in the route is called Histidinol Dehydrogenase and is responsible for the conversion of L-Histidinol into LHistidine.Its essentiality to the bacilli was confirmed by gene knockout, confirming its potential for the development of inhibitory compounds. In this work, a purification protocol was developed, producing the enzyme in the homogeneous form in quantities sufficient to carry its biochemical characterization. The enzyme needs a divalent metal ion in the active site to catalyze the reaction. The kinetic constants were determined, as well as the mechanism, the pH rate profiles and the interaction of its substrates and products by isothermal titration calorimetry. A tridimensional model for its structure was constructed by sequence homology, allowing the analysis of the interaction of the substrates and metal in the active site. The results obtained will allow the rational design of molecules that act as inhibitors.