Determinação de efeito de drogas antitumorais in vitro em diferentes estratégias de cultura celular

Abstract

Câncer ainda mata milhões de pessoas a cada ano, se vê então a importância do desenvolvimento de novas terapias e de estratégias para melhorar a testagem de novas drogas. Assim, essas duas abordagens foram consideradas no desenvolvimento deste projeto. Primeiramente foi avaliado o potencial terapêutico de uma proteína que inibe a proteína de choque térmico Hsp70. A chaperona Hsp70 apresenta expressão elevada em tumores, onde pode agir promovendo-o; ela precisa, todavia, de outras proteínas para que consiga exercer suas funções de chaperona. Uma dessas proteínas é a cochaperona Hsp70 Binding Protein-1 (HspBP1), que age inibindo a Hsp70. Experimentos preliminares de nosso grupo demonstraram que tumores que superexpressavam HspBP1 tinham seu crescimento reduzido in vivo. Assim, foi analisado o potencial antitumoral da HspBP1 em combinação ou não com quimioterápicos. Para isso, diferentes linhagens celulares foram cultivadas in vitro e tratadas por 48 h, após o qual foram avaliadas quanto a viabilidade (MTT), densidade celular (Microscopia óptica estática e ao longo das 48 h), morte celular (LDH) e apoptose (Anexina/PI). O tratamento de HspBP1 não teve ação antitumoral significativa, mostrando que o tratamento in vitro dessa proteína não foi nem citotóxico, nem citoestático, assim seu efeito in vivo deve ser indireto. Em relação a segunda parte, foi feita uma análise comparativa de diferentes modelos de cultivo in vitro tridimensionais (3D), visto que eles conseguem se aproximar mais do que é visto in vivo. Assim, crescimento celular, morfologia, resposta a quimioterapia e expressão de RNA foram analisados em diferentes modelos de cultura. Os modelos utilizados foram: clássico 2D; cultivo em gel feito a partir de um extrato tumoral (gel EHS, como Matrigel®); membrana eletrofiada; membrana produzida por Solvent Casting Particle Leaching (SCPL); e por fim, tumor in vivo. Os arcabouços para cultivo 3D foram analisados por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) em relação a tamanho de poro. Foi visto que o gel apresentava o menor tamanho de poro, seguido pela membrana eletrofiada e por fim pela SCPL. Células de melanoma B16F10GFP foram cultivadas por 7 dias in vitro e 10 dias in vivo, após o qual foi feita analise por MEV. Como esperado, células crescidas em lamínula de vidro apresentaram morfologia achatada e alongada, enquanto aquelas em 3D eram mais variadas, incluindo formação de agregados celulares e de esferoides. Essa morfologia encontrada nos modelos 3D se assemelhou mais aquelas in vivo. Para analisar resistência a quimioterapia, após os 7 dias em cultura amostras foram tratadas por 48 h com cisplatina, seguida de análise de viabilidade por MTT. No geral, foi possível ver uma tendência a resistência nos modelos 3D, porém apenas células na membrana eletrofiada apresentaram resistência significativa ao tratamento. Por fim, análise de RNA mostrou similaridades entre os modelos de cultivo 3D, confirmando dados morfológicos. Dessa forma, o cultivo celular em qualquer um dos modelos 3D testados foi capaz de se aproximar mais a um tumor in vivo, mostrando que alternativas sintéticas têm o potencial de reduzir o uso de modelos derivados de animais para cultivo 3D.

Cancer has caused millions of deaths every year across the world, evidencing the importance of drug discovery and improving in vitro drug testing. With that in mind, those two approaches have been considered for this work. First, was studied a protein which can inhibit Hsp70, thus potentially acting as a new anticancer therapy. The chaperone Hsp70 has been shown to be upregulated in various tumors, where it can inhibit cell death and promote tumor growth. In order for Hsp70 to work properly, it associates with different cochaperones, one of which is the Hsp70 Binding Protein 1 (HspBP1). Preliminary experiments from our group showed that tumors overexpressing HspBP1 grew considerably less than regular ones. As such, the potential for HspBP1 as an anticancer therapy in combination or not with chemotherapy was analyzed. Cells were cultured in vitro and treated for 48 h before analysis of: viability (MTT), cell density (Optical microscopy, static and over 48 h), cell death (LDH) and apoptosis (Annexin/PI). Although there were slight antitumor effects, they were not significant, showing that in vitro HspBP1 was unable to promote neither cytotoxic, nor cytostatic effects. For the second part, the usage of three-dimensional (3D) models for in vitro culture were studied, since it has been shown that growing cells on scaffolds may approximate in vitro to in vivo cell growth. Thus, cell growth, morphology, response to chemotherapy and RNA expression were analyzed across different culture models. These models encompassed classical 2D culture; culture on a gel made from a tumor extract (EHS gel, such as Matrigel®); an electrospun; a scaffold produced by Solvent Casting Particle Leaching (SCPL); and cells grown in vivo. Through Scanning Electron Microscopy (SEM) 3D scaffolds were analyzed regarding pore size. It could be seen that the gel had the smallest pore diameters, followed by the electrospun and then the SCPL membrane. Melanoma B16F10 GFP cells were cultured in vitro for 7 and in vivo for 10 days, after which morphology was also analyzed through SEM. As expected, cells grown on a glass slide appeared flat and elongated, while cells on 3D had different morphologies, including the formation of cell aggregates and spheroids. Cells on 3D had morphologies more similar to those grown in vivo. When analyzing resistance to chemotherapy, after culture cells were treated for 48h with cisplatin, followed by viability analysis through MTT. Though 3D cultures in general had a tendency for cisplatin resistance, only those grown on electrospun membranes had significant resistance. At last, RNA analysis showed similarities across 3D culture models, confirming morphological results. As it is, cell growth on any of the 3D culture models shown was able to better reproduce in vivo culture than the 2D model, showing the potential of synthetic scaffolds to reduce the usage of animal derived models for 3D growth.