Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10923/4409
Type: masterThesis
Title: Produção da enzima antileugêmica L-Asparaginase II a partir da clonagem do Gene ErA de Erwinia Carotovora Supsp. Atroseptica em Escherichia Coli
Author(s): Wink, Priscila Lamb
Advisor: Santos, Diógenes Santiago
Publisher: Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul
Graduate Program: Programa de Pós-Graduação em Medicina e Ciências da Saúde
Issue Date: 2009
Keywords: MEDICINA
LEUCEMIA
ENZIMAS
PROTEÍNAS
TERAPÊUTICA
HIPERSENSIBILIDADE
Abstract: As enzimas L-asparaginase do tipo II catalisam a hidrólise de L-asparagina a Laspartato e amônia e, em menor quantidade, a hidrólise de L-glutamina. Escherichia coli e Erwinia chrysanthemi são as principais origens das L-asparaginases II utilizadas como agentes terapêuticos no tratamento da leucemia linfoblástica aguda infantil. Entretanto, sua atividade de glutaminase tem sido relatada, causando graves efeitos colaterais. Felizmente, a L-asparaginase II obtida de Erwinia carotovora possui baixa atividade de glutaminase, representando uma importante terapia alternativa. Neste trabalho é descrita a clonagem, expressão, purificação e determinação dos parâmetros cinéticos em estado estacionário para duas construções de L-asparaginase II de E. carotovora: com (AspSP) e sem peptídeo-sinal (AspMP). AspMP foi purificada à homogeneidade por um protocolo de uma etapa com 81% de rendimento, enquanto que AspSP por um protocolo de duas etapas com 35% de rendimento. Os valores de Km e kcat para as atividades de L-asparaginase e de L-glutaminase foram determinados para ambas as proteínas. A análise de especificidade para os substratos indicou que a L-asparagina é o melhor substrato que a L-glutamina para a AspSp quando comparado à AspMP. Entretanto, a AspMP é produzida por um protocolo de purificação simples que fornece um alto rendimento da enzima. Este processo pode ser adaptado para uma produção em larga escala e ser interessante para as pesquisas e companhias biofarmacêuticas.
L-Asparaginase type II enzymes catalyze the hydrolysis of L-asparagine to L-aspartate and ammonia, and to a lesser extent the hydrolysis of L-glutamine. Escherichia coli and Erwinia chrysanthemi are the main sources of L-asparaginases II used as therapeutic agents in the treatment of acute childhood lymphoblastic leukaemia. However, their glutaminase activity has been implicated in causing serious side effects. Fortunately, L-asparaginase II from Erwinia carotovora has significantly lower glutaminase activity and may represent an important alternative therapy. Here we describe cloning, expression, purification and determination of steady-state kinetic parameters for two constructs of E. carotovora Lasparaginase II: with (AspSP) and without the signal peptide (AspMP). AspMP was purified to homogeneity by a single-step protocol with 81 % yield, and AspSP by a two-step protocol with 35 % yield. The Km and kcat values for L-asparaginase and L-glutaminase activities were determined for both proteins. Analysis of specificity for competing substrates indicates that Lasparagine is a better substrate than L-glutamine for AspSP as compared to AspMP. However, the latter is produced by a simpler purification protocol and at higher yield. This process can be amenable to large scale production and be of interest to researchers and biopharmaceutical companies.
URI: http://hdl.handle.net/10923/4409
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