Análise in vitro da citotoxicidade e proliferação celular em equivalentes de pele humana

Abstract

Introdução: Há uma grande necessidade de suprir a demanda por enxertos de pele autólogos humanos, fundamentais para tratamento de pacientes sujeitos as situações particulares como úlceras, queimaduras, traumas entre outras. Polímeros naturais e sintéticos têm sido desenvolvidos e empregados como biomaterias. A aplicação de testes visando avaliar o comportamento celular na presença do biomaterial in vitro poderá abreviar as etapas necessárias para atestar sua biocompatibilidade. A análise com as metodologias proposta pelas normas da ISO 10993 permite o estabelecimento de uma escala ordenada e racional para a biocompatibilidade dos materiais em função de sua citotoxicidade. Essa padronização poderá auxiliar na comparação de diversos biomateriais utilizados em estudos e, na produção de novas matérias, contribuindo para o desenvolvimento da bioengenharia dos tecidos. Os materiais analisados e utilizados como equivalentes de pele humana podem ter sua citotoxicidade mediada por alterações da função mitocondrial das células, determinada pelo teste de MTT. Objetivos: (1) Avaliar a citotoxicidade dos extratos dos Equivalentes de Pele Humana (EPH) Veloderm® e Biopiel® no cultivo de fibroblastos da linhagen celular NIH-3T3, através do teste colorimétrico de MTT; (2) classificação dos extratos puros dos EPH através de escala de citotoxicidade, de acordo com as normas da ISO 10993. Metodologia: Foram utilizados como substâncias-teste extratos de Equivalentes de Pele Humana (EPH) Veloderm® (VL) e Biopiel® (BP).Fibroblastos da linhagem NIH-3T3 foram semeados em três placas de cultural de 96 poços na concentração de 4,5 × 104 células por poço. As células foram cultivadas na presença de concentrações distintas dos extratos das substâncias-teste, obtidos segundo as normas da ISO 10993 por 24, 48, e 72 horas para a determinação do grau de citotoxicidade das substâncias-teste quando comparadas ao controle de positivo (CP) e negativo de citotoxicidade (CN), através do teste de MTT. Resultados: na comparação entre os Grupos (CN, CP, BP, VL), os dados mostraram que houve diferença significativa na citotoxicidade (p<0,001) no CP contra CN, BP e VL dos extratos puros de cultivo, nos diferentes tempos de exposição (24, 48 e 72 horas). Não houve diferença significativa da citotoxicidade do Grupo BP e VL contra CN. Houve diferença de citototoxicidade (p=0,01) quando extratos de 10% em cultura celular de 48 horas foram usados nos Grupos VL (17,4±1,4) e BP (14,5±0,6). Uma diferença também foi detectada na citotoxicidade (p=0,014) no Grupo BP em 48 horas de cultura, entre o extrato de 10% (14,5±0,6) contra os extratos de 60% (16,7±1,0) e 100% (17,0±1,3). O Grupo VL em cultura de 72 horas mostrou uma diferença na citotoxicidade (p=0,041) quando comparados os extratos de 60% (21,3±1,6) e 100% (17,5±2,1).A viabilidade celular dos extratos do Veloderm® e Biopiel® independente do tempo de exposição e concentração encontraram-se entre 75% e 100% na comparação com CN. Segundo a classificação baseado na ISO 10993, ambos os extratos puros de EPH foram definidos não tóxicos (NT). Conclusão: O conjunto dos resultados sugere alta biocompatibilidade dos EPHs testados; entretanto, o teste colorimétrico de MTT representa uma avaliação inicial, sendo importante seu papel na racionalização da experimentação in vivo e clínica dos biomateriais. Esta hipótese precisa ser confirmada com testes complementares segundo normas da ISO 10993.

Evaluation of in vitro cell behavior with biomaterials may shorten the stages required to certify its compatibility. The methods proposed by ISO 10993 standards allow the ordered, and a rational scale to determine the materials biocompatibility regarding its cytotoxicity. This standardization may help to compare different biomaterials used in experimental studies, and the production of new and safe materials, contributing to the development of tissue bioengineering. Human skin equivalents frequently used may have their cytotoxicity mediated by changes in mitochondrial function, determined by MTT test. The cytotoxicity of Human Skin Equivalents (HSEs) Veloderm® and Biopiel® in NIH-3T3 cell line fibroblasts culture (4. 5 × 104 cells/well) were assayed in the presence of different extracts concentrations according to the ISO 10993 standards per 24, 48 and 72 hours, and the degree of cytotoxicity was determined by the MTT test. There was a difference in cytotoxicity between VL and BP on 48 hours cell cultures when 10% extracts was used (p=0. 01). A difference was also detected regarding BP concentrations in 48 hours cultures that shown a reduction in cytotoxicity with increasing extracts concentrations (10% to 60%) (p=0. 014). VL extract concentrations on 72 hours cultures also shown a difference in cytotoxicity, when in cytotoxicity with increasing extracts concentrations (60% to 100%) (p=0. 041). According to ISO 10993 classifications, both extracts of HSE were defined as non-toxic (NT) suggesting a high biocompatibility of Veloderm® and Biopiel®. This hypothesis should be confirmed with complementary tests, although the colorimetric MTT test is an initial evaluation to rationalize the application of biomaterials in vivo and in clinical experimentation.