Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10923/5299
Type: doctoralThesis
Title: Clonagem, expressão e purificação de antígeno recombinante no imunodiagnóstico da angiostrongilíase abdominal
Author(s): Silva, Ana Cristina Arámburu da
Advisor: Graeff-Teixeira, Carlos
Publisher: Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul
Graduate Program: Programa de Pós-Graduação em Zoologia
Issue Date: 2007
Keywords: ZOOLOGIA
PARASITOS
NEMATÓDEOS
DOENÇAS PARASITÁRIAS
PROTEÍNAS DO CHOQUE TÉRMICO
DIAGNÓSTICO
Abstract: Angiostrongilíase abdominal é uma infecção zoonótica causada por Angiostrongylus costaricensis, um nematódeo com uma localização intra-vascular no mesentério. O diagnóstico é realizado somente com exame patológico de fragmentos do tecido ressecado, durante o tratamento cirúrgico de curso clínico complicado (perfuração intestinal e/ou obstrução). Métodos de imunodiagnóstico mostram muitas dificuldades com reação cruzada de anticorpos e a diversidade de resposta humoral. Esforços têm sido direcionados para uma contribuição na identificação e purificação de antígenos específicos de parasitos no desenvolvimento de métodos sorodiagnósticos. No presente estudo, foi analisado o uso de uma proteína recombinante de A. costaricensis, a proteína de choque térmico (HSP 20), em ELISA como sorodiagnóstico. Um dos clones de cDNA, obtido e expresso como uma pequena proteína de choque térmico HSP 20 com 147 aminoácidos, apresentou identidade com seqüências de pequenas proteínas de choque térmico de outros nematódeos. A seqüência correspondente foi sub-clonada no vetor de expressão pET-23a-d (+), utilizando a técnica de PCR para a construção da proteína recombinante HSP 20. O alto nível de expressão de HSP 20 em Escherichia coli BL 21 (DE3), clonado no vetor de expressão, foi observado após indução com 1 mM de IPTG a 37 ºC. A etapa da purificação do recombinante HSP 20 foi realizada com a resina de Ni-NTA. Análise do Western blot utilizando soro de um paciente com diagnóstico confirmado para angiostrongilíase abdominal, indicou que o produto de expressão purificado foi imunogênico. A sensibilidade da HSP 20 foi de 33%. Entretanto, 100% de especificidade da proteína recombinante sugere o uso de um painel de antígenos, na tentativa de múltiplos testes de varredura, para um sorodiagnóstico melhor e preciso da angiostrongilíase abdominal.
Abdominal angiostrongyliasis is a zoonotic infection caused by Angiostrongylus costaricensis, a nematode with an intra-vascular location in the mesentery. The diagnosis is only achieved with a pathological examination of tissue fragments ressected during surgical treatment in complicated clinical courses (intestinal perforation and/or obstruction). Immunodiagnostic test show many difficulties with cross-reacting antibodies and diversity of the humoral reactivity. Therefore, efforts have been directed towards identification and purification of parasite specific antigens for development of serodiagnosis methods. In the present study we analized the use of recombinant A. costaricensis heat shock protein (HSP) 20 in ELISA for the serodiagnosis. One of the cDNA clones, obtained and expressed a small heat shock protein HSP 20 with 147 amino acids, which had high sequence identity with other nematode small heat shock proteins. The gene enconding the HSP 20 was sub-cloned using PCR technique. The sequence corresponding was subcloned in the pET-23a-d (+) expression vector, to construct a recombinant HSP 20 protein containing six histidine residues at the Nterminal. High level expression of the HSP 20 by Escherichia coli BL21 (DE3) harbouring the HSP 20 gene and containing its expression vector was observed upon induction with 1 mM IPTG at 37 °C. One-step purification of the recombinant HSP 20 was achieved with Ni-NTA resin. Western blot analysis, using sera from patients with confirmed angiostrongyliasis abdominal, indicated that the purified HSP 20 expression product was immunogenic. Sensitivity of ELISA-HSP 20 was 33%. However, 100% specificity of this recombinant protein suggests its usefullness in combination with other antigen molecules, in an approach of multiple screening tests for the most accurate serodiagnosis of abdominal angiostrongyliasis.
URI: http://hdl.handle.net/10923/5299
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