Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10923/8310
Type: doctoralThesis
Title: Estudo de glicídios de Angiostrongylus cantonensis e o papel no imunodiagnóstico
Author(s): Veríssimo, Carolina de Marco
Advisor: Graeff-Teixeira, Carlos
Morassutti, Alessandra Loureiro
Publisher: Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul
Graduate Program: Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Issue Date: 2015
Keywords: TESTES IMUNOLÓGICOS
CARBOIDRATOS
NEMATÓDEOS
BIOLOGIA MOLECULAR
Abstract: Angiostrongylus cantonensis is a nematode parasite, main etiologic agent of the eosinophilic meningitis (EM) in humans, a disease endemic in many tropical and sub tropical countries. The diagnosis of EM involves clinical evaluation, eosinophils counting >10% in liquor, and consuming historical of raw mollusks, as they are the intermediate hosts of the Angiostrongylus. Definitive diagnosis through larvae visualization in the liquor is rare. Serological test, mainly involving the 31-kDa component detection, which presents high sensitivity and specificity, has been employed as an alternative way for diagnostic. The 31-kDa antigen is composed for glycoproteins and tentatives in producing it in a recombinant way, using either prokaryotic or eukaryotic models, were inable to mantain immunological recognition, probably due the lack or deficient glycosilation of the molecules. Due the lack of information about A. cantonensis glycans and the need of producing a standard antigen able to be used worldwide in a diagnostic test, the main goal of this work was to study the A. cantonensis glycan profile and their role on the immune diagnosis of EM. It was used total soluble extract (TE) and excretory-secretory products (ES) as sources of glycans and glycoconjugates. The N-linked glycans and glycoconjugates from A. cantonensis female TE and 31-kDa antigen were analyzed and identified by mass spectrometry (MS) and lectin array, and the immunogenecity of these molecules were characterized by dot blot and Western blots. Furthermore, It was investigated the biosynthesis routes of glycans using in silico analysis of the Angiostrongylus genome and transcriptome dataset. N-glycans containing complex structures, with truncated antennas containing terminal with galactose and N-acetylgalactosamine, and core α1-6 fucosylated were identified. Lectin array analysis could also dentify Gal and GalNAc structures in Angiostrongylus glycoconjugates. Eight genes involved with biosynthesis of N-glycans, among them GCS1; GANAB, MAN1, MGAT2 and FUT8; and three involved with O-glycan biosynthesis, GALNT, C1GALT1 e OFUT1 were found by in silico analysis. Immunogenicity of the 31-kDa antigen is tottaly dependent of N-glycans and not to O-glycans. Modeling of proteins of the 31kDa component showed N-glycosilation sites and predicted structures that were the same identified by MS analysis. Taking together, the data generated in this study shown the glycan importance for angiostrongyliasis diagnosis and also the glycan repertoire that Angiostrongylus produces. This work is an important contribution to the development of a standard diagnosis for EM and also for new perspectives in the study of angiostrongyliasis diagnosis, parasite biology and host-parasite relationship.
Angiostrongylus cantonensis é um nematódeo parasita, principal agente etiológico da meningite eosinofílica (ME) em humanos, doença endêmica em diversos países tropicais e subtropicais. A ME se caracteriza pela eosinofilia >10% no líquor, e histórico de ingestão de moluscos crus, já que estes são hospedeiros intermediários do Angiostrongylus. O diagnóstico definitivo é raramente possível através da visualização da larva no liquor. Testes sorológicos envolvendo principalmente a detecção do componente de 31-kDa, que apresenta alta sensibilidade e especificidade, tem sido empregados como uma alternativa diagnóstica. O antígeno de 31-kDa é composto por glicoproteínas e tentativas em produzi-lo de maneira recombinante, em modelos procarióticos ou eucarióticos, não tiveram sucesso em manter o reconhecimento imunológico, provavelmente pela incorreta ou insuficiente glicosilação das moléculas. Devido à falta de informação sobre glicídios de A. cantonensis e a necessidade de produzir um antígeno padrão capaz de ser usado em um teste de diagnóstico para distribuição mundial, o objetivo principal deste trabalho foi estudar o perfil glicídico de A. cantonensis e o papel dessas moléculas no imunodiagnóstico da ME. Foram utilizados extratos solúveis totais (ET) de vermes adultos machos e fêmeas e produtos de excreção e secreção (ES) como fontes dos glicídios e glicoconjugados estudados. Os N-glicídios e glicoconjugados do ET de verme fêmea de A. cantonensis e o antígeno de 31-kDa foram analisados e identificados por espectrometria de massa (EM) e lectina array, e a importância imunogênica destas moléculas foi caracterizada por tratamento com glicosidases aliado a dot blot ou Western blot. Além disso, foi investigada a presença de enzimas envolvidas na síntese de diferentes glicídios a partir de análises in silico do genoma e transcriptoma do Angiostrongylus. Diversos N-glicídios foram identificados nas amostras analisadas. Estes continham estruturas complexas, com antenas truncadas contendo galactose e N-acetilgalactosamina em posições terminais e núcleo α1-6 fucosilado. As mesmas estruturas terminais foram identificadas pela análise de Lectin Array. Em relação a análise in sílico da biossíntese de glicídios em Angiostrongylus, foram identificados oito genes envolvidos na síntese de N-glicídios, entre eles GCS1; GANAB, MAN1, MGAT2 e FUT8; e pelo menos três genes envolvidos na síntese de O-glicídios, GALNT, C1GALT1 e OFUT1. Os N-glicídios se mostraram essenciais para a imunogenicidade do antígeno de 31-kDa quando soros positivos para A. cantonensis foram testados. Uma modelagem in silico dos componentes de 31-kDa, demonstrou sítios de glicosilação para N-glicídios, e previu as mesmas estruturas que foram identificadas por EM. Em conjunto, os dados gerados neste estudo mostraram a importância de glicídios para o diagnóstico de angiostrongilíases e também o repertório de glicídios que este parasito pode produzir. Este trabalho é uma contribuição importante para o desenvolvimento de um diagnóstico padrão para a ME e também para novas perspectivas no estudo do diagnóstico de angiostrongilíases, biologia do parasito e relação parasito-hospedeiro.
URI: http://hdl.handle.net/10923/8310
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