| Abstract: | Changes in the cerebral cortex development are presented as a group of distinct defects with a not well-defined pathogenesis. The focal cortical dysplasia (FCD) is one of the most frequent form of cortical development malformation, that encompasses multiple types of changes both in the cortical architecture and cytological abnormalities. It is an underlying pathology of a significant proportion of partial epilepsy refractory to drug treatment. Especially the limited number of cases and the lack of suitable experimental models rarely document the mechanisms involved with the genesis of FCD. The scarse predictive preclinical models that can be used to study the pathophysiology and to translate the therapeutic discovery from animal models to human use, strengthens the need to study the brain development from cells originated from patients that harbor these central nervous systems diseases. The generation of iPSC cells and the differentiation into specific cells and tissues will provide important testing and an unique ability to study the development and progress of CNS diseases. The objective of this study was to establish a cellular model of focal cortical dysplasia through the generation of induced pluripotent stem cells (iPSC) from fibroblasts derived from affected patients. Human fibroblasts were obtained from skin biopsies from two patients and cultured up to the fifth passage. Immunofluorescence analysis of AKT/mTOR signaling pathways was performed in the dysplastic brain tissue. iPSC cells were generated from fibroblasts through transfection with a viral vector containing the genes OCT4, KLF4, SOX2, and C-MYC and characterized by immunohistochemistry. Cell migration co-cultured with fibroblast and iPSC was investigated. Morphological and molecular characterization of neurodifferentiated iPSC were performed by immunohistochemistry and PI3K/ATK/mTOR signaling pathway analysis. Both patients were diagnosed with FCD type IIb. The AKT and mTOR phosphorylated and non-phosphorylated was higher in brain sections from patient 01. iPSC clones from patients and controls were generated from skin fibroblasts. Both iPSC from patients and controls showed polarization and morphology similar to nerve cells. In the cell migration assay, fibroblasts derived from FCD migrate with greater intensity within 24 hours (p<0,0001) and 48 hours (p<0,001), and iPSC cells did not present difference in cell migration. During neurodifferentiation, iPSC cells from patients with FCD showed lower values of 4EBP-1, β-catenin, CIAP-1, CIAP-2 and PI3K, and higher values of MCL 1 gene expression. Changes in cell migration in adult tissue, uncontrolled cell proliferation, cell adhesion protein deficiency, and alterations in the expression of genes responsible for apoptosis and PI3K pathway that are implicated with an complete and well successful CNS formation. Alterations in some of these were detected in cells and iPSC from patients with FCD and may be related to the ethiopathology of the disease.
As alterações do desenvolvimento do córtex cerebral apresentam-se como um grupo de malformações com uma distinção e patogênse ainda não bem definidas. A displasia cortical focal (DCF) é uma das formas mais frequentes de malformações do desenvolvimento cortical, sendo a patologia subjacente a uma parcela significativa de epilepsias parciais refratárias ao tratamento medicamentoso. A displasia cortical focal engloba múltiplos tipos de alterações tanto na arquitetura cortical quanto em anormalidades citológicas. Palmini e colaboradores classificaram as displasias corticais focais de acordo com observações na substância branca e na arquitetura da camada cortical. Os mecanismos envolvidos na gênese da DCF são pouco investigados, principalmente pelo número limitado de casos e a falta de modelos experimentais adequados e suas causas provavelmente estão relacionadas a mutações somáticas. A falta de modelos pré-clínicos preditivos que possam ser utilizados no estudo da fisiopatologia e o histórico enfraquecido quando se trata em traduzir a descoberta terapêutica de modelos animais para o uso humano, fortalece a necessidade de estudar o desenvolvimento cerebral a partir de células originadas do próprio paciente. A geração de células iPSC e diferenciação tecidual específica de células de pacientes acometidos por doenças neurológicas relevantes possui um valor inestimável para a realização de testes além de fornecerem uma capacidade adicional e única para estudar o desenvolvimento inicial e a progressão das patologias associadas ao SNC. O objetivo do presente trabalho é estabelecer um modelo celular de Displasia Cortical Focal através da geração de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) a partir de fibroblastos de pacientes afetados. Fibroblastos humanos foram obtidos de biópsias de pele de dois pacientes com DCF e foram cultivados até a quinta passagem. Foi realizada análise imunopatológica e das vias de sinalização AKT/mTOR no tecido cerebral displásico. Células iPSC foram geradas a partir dos fibroblastos através da exposição a vetores virais contendo os genes OCT4, KLF4, SOX2, e C-MYC e caracterizadas por imunohistoquímica. Foi realizado ensaio de migração celular dos fibroblastos (24h, 48h e 72h) e das iPSC (3 dias e 7 dias). As células iPSC foram neurodiferenciadas e analisadas nos períodos de 14 dias, 22 dias e 35 dias. Nesses períodos, foram realizadas análises morfológicas, imunohistoquímica (polarização) e moleculares (genes relacionados a via PI3K/ATK/mTOR). Ambos os pacientes foram diagnosticados com DCF tipo IIb. O paciente 01 apresentou valores maiores que o paciente 02 em relação à área marcada das vias AKT e mTOR, tanto na via fosforilada como não fosforilada no tecido cerebral, com diferenças estatisticamente significativas. Clones iPSC dos pacientes e controles foram gerados e caracterizados a partir dos fibroblastos de pele. Tanto as iPSC dos pacientes quanto do controle apresentaram morfologia e polarização semelhante a células nervosas após protocolo de neurodiferenciação. No ensaio de migração celular, fibroblastos com DCF migraram com mais intensidade em 24 horas (p<0,0001) e 48 horas (p<0,001). As células iPSC não apresentaram diferença no potencial de migração celular nos períodos analisados. Durante o protocolo de neurodiferenciação, as células iPSC dos pacientes com DCF apresentaram valores menores de expressão dos genes 4EBP-1, β-Catenina, CIAP-1, CIAP-2 e PI3K, e valores mais elevados da expressão de MCL 1.Alterações na migração celular no tecido adulto e em processos como de proliferação celular acentuada, deficiência de proteína de adesão celular, alteração na expressão de genes responsáveis pelo controle de apoptose e alteração na via PI3K responsável no sistema nervoso central pela sobrevivência celular, controle de apoptose, migração neuronal, desenvolvimento morfológico dos neurônios e formação das neurotransmissões, puderam ser evidenciadas nas células dos pacientes com DCF em relação aos pacientes controle e podem estar relacionadas com a formação do cérebro com displasia. |
