| Resumen: | The LPS mechanism of action is still not completely elucidated on vertebrates like fish, and indeed differs from higher vertebrates. In zebrafish, LPS is capable of increasing the recruitment of immune cells and the expression of genes related to the immune response. The purinergic system has a great relation to the regulation of the immune system and inflammatory responses. The nucleotide ATP is able to induce cytokine secretion, recruitment and differentiation of immune cells. ATP can be dephosphorylated sequentially generating adenosine. In the context of inflammation adenosine serves as an innate immunomodulatory molecule. The control of adenosine extracellular levels is performed by nucleoside transporters and ecto-5'-nucleotidase. The ecto-5'-nucelotidase is an ectonucleotidase with pacemaker role in the production of adenosine and is one of the focuses of this study. Considering the analysis of the input images approach to the study of inflammation context, it is known that in rodents the uptake of 18F-FDG, an analogue of glucose, is increased under inflammation, which generates a differential image. The micro Positron Emission Tomography/ Computed Tomography (µPET /CT) is used for research in small animals and take images using a radiopharmaceutical. The use of µPET/CT contributes with information at the molecular, structural and functional level and allows too monitor the effect of drugs in physiological / pathological situations in the range of a small animal as the zebrafish. The technology µPET/CT is relatively new and so far there are no published scientific studies applying radiopharmaceuticals in zebrafish. In this context, the aim of the project was to study the involvement of the enzyme ecto-5'-nucleotidase in the development of inflammation induced by LPS using the cytological, biochemical, molecular and image (µPET) in different tissues of adult zebrafish (Danio rerio).To induce inflammation in zebrafish, the animals were injected with a solution of LPS (10 ug/g body weight, i. p) after being subjected to anesthesia (tricaine 0. 1 g/L). The animals were kept for 2 hours or 24 hours in this treatment. For confirmation of inflammation were analyzed the gene expression of specific markers (tnf-a and cox-2) in encephalon, heart, kidney and intestine and differential counts of cells of the immune system. The activity and expression of ecto-5'-nucleotidase enzyme was analyzed in the encephalon, heart, kidney and intestine of control and treated animals. To keep the animals in µPET/CT was performed anesthetic concentration curve (tricaine - 0. 1, 0. 12, 0. 15 g/L) and standardized an apparatus to keep the fish in the presence of water, but yet still. A curve of time after injection of 18F-FDG was performed to obtain images in µPET/CT (0, 10, 20 and 30 min) for standardizing the radiation quantitation in a gamma counter (15, 30, 60 90 and 120 min). Exposure to the LPS was able to increase the tnf-a expression in nearly all tissues studied (heart, kidney and intestine) and cox-2 in the kidney. The number of active peripheral blood white cells was also increased, confirming the induction of the inflammatory response. Hydrolysis of AMP in animals injected with LPS was increased in the heart in 24 hpi [72% compared to control] with no change in gene expression of ecto-5'-nucleotidase. The gene expression of ecto-5'-nucleotidase was adjusted temporarily in the kidney and intestine without altering the enzyme activity. After patterning images with µPET/ CT and quantitation radiation by gamma counter for each organ examined, 30 minutes was defined as the best time for the biodistribution of 18F-FDG.After acquiring inflamed animal µPET images it was not identified changes in the uptake of 18F-FDG compared to the control. Tissue quantification radiation registered a decrease in bone samples in animals treated with LPS, while other tissues have not changed. These data indicate that zebrafish responds to LPS by altering gene expression of specific markers, especially in kidney, and activation of white blood cells. The inflammation appears to be accompanied by a fine adjustment tissue-specific expression and activity of ecto-5'-nucleotidase in response to the inflammatory process. Although inflammation has been confirmed, the registration images by µPET and radiation determination in different tissues have not been able to register differences in metabolic activity in animals treated with LPS. However, standardization of these techniques provides an advance in the use of radiopharmaceuticals in small animals, such as zebrafish.
O mecanismo de ação do LPS ainda não é completamente elucidado em vertebrados como os peixes, e se diferencia dos vertebrados superiores. Em zebrafish, o LPS é capaz de aumentar o recrutamento de células imunes e a expressão de genes relacionados com a resposta imune. O sistema purinérgico tem uma grande relação com a regulação do sistema imune e as respostas inflamatórias. O ATP é um nucleotídeo importante na secreção de citocinas e no recrutamento e diferenciação de células imunes, podendo ser sequencialmente desfosforilado gerando adenosina. No contexto da inflamação, a adenosina atua como uma molécula imunomodulatória inata. Participam do controle dos níveis extracelulares da adenosina, os transportadores de nucleosídeos e a ecto-5’-nucleotidase. A ecto-5’-nucleotidase é uma enzima com papel de marcapasso na produção de adenosina e constitui um dos focos do presente estudo. Considerando a contribuição da abordagem de análise de imagens no contexto do estudo da inflamação, é sabido que a captação do radiofármaco 18F-FDG, um análogo da glicoseestá aumentada em roedores submetidos à inflamação, o que gera uma imagem diferenciada. O micro Tomógrafo por Emissão de Pósitron/Tomografia Computadorizada (µPET/CT) é utilizado para pesquisas em animais de pequeno porte e obtém imagens utilizando um radiofármaco. O uso da µPET/CT contribui com informações a nível molecular, funcional e estrutural em tempo real e permite acompanhar o efeito de fármacos em situações fisiológicas/patológicas na escala de um animal diminuto como o zebrafish. A tecnologia do µPET/CT é relativamente nova e até o momento não existem estudos científicos publicados aplicando radiofármacos em zebrafish.Neste contexto, o objetivo do projeto foi estudar o envolvimento da enzima ecto-5’-nucleotidase no desenvolvimento de inflamação induzida por LPS utilizando-se de parâmetros citológicos, bioquímicos, moleculares e de imagem por µPET em diferentes tecidos de zebrafish adulto (Danio rerio). Para induzir inflamação no zebrafish, os animais foram injetados com uma solução de LPS (10 µg/g de peso corporal; i. p) após terem sido submetidos à anestesia (tricaína 0. 1 g/L). Os animais permaneceram por 2 h ou 24 h neste tratamento. Para confirmação da inflamação foram analisadas a expressão gênica de marcadores específicos (tnf-a e cox-2) em encéfalo, coração, rim e intestino e contagem diferencial de células do sistema imune. A atividade e expressão da enzima ecto-5’-nucleotidase foi analisada no encéfalo, coração, rim e intestino dos animais controle e tratados. Para manter os animais no µPET/CT foi realizada uma curva de concentração de anestésico MS-222 (0. 1, 0. 12, 0. 15 g/L) e determinado um aparato para manter o peixe na presença de água mas, ainda imóvel. Uma curva de tempo após a injeção de 18F-FDG foi realizada para a obtenção de imagens em µPET/CT (0, 10, 20 e 30 min) e para a padronização da quantificação de radiação em um Gamma counter (15, 30, 60, 90 e 120 min). A exposição ao LPS foi capaz de aumentar a expressão de tnf-a em quase todos os tecidos estudados (coração, rim e intestino) e de cox-2 no rim. O número de células brancas ativas do sangue periférico também foi aumentado, confirmando a indução da resposta inflamatória. A hidrólise de AMP em animais injetados com LPS foi aumentada no coração em 24 hpi [72% em relação ao controle] com nenhuma alteração na expressão gênica da ecto-5’-nucleotidase. A expressão gênica do ecto-5’-nucleotidase foi ajustada temporalmente no rim e intestino sem alteração da atividade enzimática.Após a padronização de imagens com µPET/CT e da quantificação de radiação por Gamma counter para cada órgão analisado, definiu-se 30 min como o melhor tempo para a biodistribuição do 18F-FDG. Após a aquisição de imagens em µPET de animais inflamados não se identificou alterações na captação do 18F-FDG comparado com o controle. A quantificação tecidual de radiação registrou uma queda nas amostras de ossos nos animais tratados com LPS, embora os demais tecidos não tenham sido alterados. Estes dados indicam que o zebrafish responde ao LPS alterando expressão gênica de marcadores específicos, especialmente no rim e ativando células brancas do sangue. A inflamação induzida parece estar acompanhada por um tênue ajuste tecido-específico da atividade e expressão da ecto-5’-nucleotidase em resposta ao processo inflamatório. Ainda que a inflamação tenha sido confirmada, o registro de imagens por µPET e a determinação de radiação nos diferentes tecidos não foram capazes de registrar diferenças na atividade metabólica em animais tratados com LPS. Entretanto, a padronização destas técnicas oferece um avanço no uso de radiofármacos em animais de pequeno porte, como o zebrafish. |
