| Resumo: | O meio intracelular é uma solução aquosa complexa, pois é preenchida por diversos tipos de macromoléculas. Espera-se que essa grande concentração de macromoléculas resulte em um comportamento não ideal para a solução. Para mimetizar o ambiente intracelular, os efeitos do da ocupação macromolecular são comumente estudados in vitro utilizando agentes de crowding. O objetivo central do presente estudo é avaliar os possíveis efeitos de agentes de crowding macromolecular sintéticos nos parâmetros cinéticos aparentes de estado-estacionário (Km, kcat e kcat/Km) para a reação química catalisada pela 2-trans-enoil-ACP(CoA) redutase de Mycobacterium tuberculosis (InhA). Os resultados mostraram que ficoll 70, ficoll 400 e dextran 70 têm efeitos negligenciáveis na atividade da InhA na faixa de concentração utilizada. Por outro lado, um complexo efeito foi observado na presença do PEG 6000. A sacarose, que foi utilizada como controle nos experimentos, reduziu os valores de kcat/Km para o NADH e kcat para o 2-trans-dodecenoil-CoA de uma maneira concentração-dependente. Os resultados de dinâmica molecular sugerem que a InhA adota uma forma mais compacta na presença de sacarose, o que provavelmente tem efeitos nos resultados de cinética de estado-estacionário. A presença dos agentes de crowding parece alterar a abundância relativa dos diferentes confôrmeros da InhA em solução. Os efeitos do crowding macromolecular na energia (Ea e Eη), entalpia (ΔH#), entropia (ΔS#) e energia livre de Gibbs de ativação (ΔG#) foram determinados. Os valores de ΔG# para todos os agentes de crowding testados foram similares ao tampão Pipes 100 mM, sugerindo que os efeitos do volume excluído não facilitam a formação do complexo ativado estável ES#. A não linearidade do gráfico de Arrhenius para o PEG 6000 sugere que interações “brandas” possam atuar nos efeitos do crowding macromolecular.
The cellular milieu is a complex and crowded aqueous solution. It is thus expected that this large concentration of macromolecules causes deviations from solution ideality. To mimic the intracellular environment, crowding effects are commonly studied in vitro using crowding agents. The aim of the present study was to evaluate the effects of macromolecular synthetic crowding agents on the apparent steady-state kinetic parameters (Km, kcat, and kcat/Km) for the chemical reaction catalyzed by 2-trans-enoyl-ACP (CoA) from Mycobacterium tuberculosis (InhA). The results showed that ficoll 70, ficoll 400, and dextran 70 had negligible effects on InhA activity in the range of concentrations used. On the other hand, a complex effect was observed for PEG 6000. Sucrose, which was employed in control experiments, decreased both the kcat/Km values for NADH and kcat for 2-trans-dodecenoyl-CoA (DD-CoA) substrate in a concentration-dependent manner. Molecular dynamics results suggest that InhA adopts a more compact conformer in sucrose solution, which likely accounts for the steady-state kinetic results. The presence of crowding agents appears to alter the relative abundance of different conformers of InhA in solution. The effects of the crowding agents on the energy (Ea and Eη), enthalpy (ΔH#), entropy (ΔS#), and Gibbs free energy (ΔG#) of activation were determined. The ΔG# values for all crowding agents tested were similar to dilute buffer, suggesting that excluded volume effects did not facilitate stable activated ES# complex formation. Nonlinear Arrhenius plot for PEG 6000 suggests that "soft" interactions may play a role in macromolecular crowding effects. |
