| Resumen: | A tuberculose (TB) tornou-se a principal causa mundial de morte por doenças infecciosas. Em 2015, de acordo com a OMS, surgiram 10,4 milhões de novos casos de tuberculose no mundo. Atualmente os tratamentos comumente utilizados não são eficientes contra as formas da doença resistentes aos fármacos anti-TB mais eficazes, sendo necessários fármacos com novos mecanismos de ação. A di-hidroneopterina aldolase de Mycobacterium tuberculosis (MtDHNA/FolB) é uma enzima da via do folato, codificada pelo gene folB, que apresenta características importantes que a tornam um potencial alvo para síntese de novos agentes antimicrobianos. Neste estudo, por meio de mutagênese sítio-direcionada, análises bioquímicas e experimentos de nocaute gênico, demostramos que o gene folB é essencial para a sobrevivência de Mtb, e além disso provamos que essa essencialidade depende das atividades de aldolase/epimerase da proteína MtFolB. O gene do tipo selvagem (wt) e os mutantes pontuais K99A e Y54F foram clonados e expressos, e as proteínas recombinantes correspondentes foram purificadas e monitoradas para as atividades de aldolase, epimerase e oxigenase utilizando HPLC. Em contraste com a enzima MtFolB selvagem (wt), ambas as mutantes não apresentaram atividade de aldolase nem de epimerase nas condições testadas. A mutante Y54F manteve a atividade da oxigenase, enquanto que para a mutante K99A foi possível detectar a atividade de oxigenase apenas na presença de HP e GA como substratos. Os experimentos de nocaute mostraram que o gene folB é essencial para a sobrevivência de Mtb sob as condições testadas.Entretanto, diferentemente da cópia selvagem, quando as sequências que codificam os mutantes K99A ou Y54F foram utilizadas para complementação, não foram obtidas colônias viáveis, indicando que estes mutantes pontuais não poderiam resgatar as células após o nocaute do gene folB. Esses resultados indicam que as atividades de aldolase e/ou epimerase são cruciais para a sobrevivência de Mtb. A construção de cepas com fusão folB-GFP de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) que contêm a sequência do tipo selvagem do gene folB ou um mutante com o C-terminal deletado (folBΔC), desprovida da sequência supostamente necessária para a ancoragem da enzima dentro dos compartimentos de nanocargas, foram realizadas e juntamente com outros métodos de biologia celular descritos neste trabalho também poderão ser utilizados para um melhor entendimento das funções celulares apresentadas por MtDHNA/FolB e para validação dessa enzima como potencial alvo terapêutico.
Tuberculosis (TB) has become the leading global cause of death from infectious diseases. In 2015, according to WHO, 10.4 million new cases of tuberculosis worldwide have emerged. Currently the commonly used treatments are not effective against the forms of disease resistant to the most effective anti-TB drugs, and drugs with new mechanisms of action are needed. Mycobacterium tuberculosis dihydroneopterin aldolase (MtDHNA /FolB) is a folate enzyme encoded by the folB gene, which has important properties that make it a potential target for the synthesis of new antimicrobial agents. As a first step for target validation in the antimicrobial drug development pipeline, it is important to prove that the gene encoding a putative target is essential for pathogen’s viability. In this study, using site directed mutagenesis, biochemical analyzes and gene knockout experiments, we demonstrated that the folB gene is essential for the survival of Mtb, and furthermore we prove that this essentiality depends on the aldolase/epimerase activities of the MtFolB protein. The wild-type gene (wt) and the point mutants K99A and Y54F were cloned and expressed, and the corresponding recombinant proteins were purified and monitored for the activities of aldolase, epimerase and oxygenase using HPLC. In contrast to the wild-type MtFolB (wt) enzyme, both mutants had neither aldolase nor epimerase activities under the conditions tested. The Y54F mutant maintained oxygenase activity, whereas for the K99A mutant it was possible to detect oxygenase activity only in the presence of HP and GA as substrates.Knockout experiments showed that the folB gene is essential for the survival of Mtb under the conditions tested. However, unlike the wild-type copy, when the sequences encoding the K99A or Y54F mutants were used for complementation, no viable colonies were obtained, indicating that these point mutants could not rescue the cells after the folB knockout. These results indicate that aldolase and/or epimerase activities are crucial for the survival of Mtb. The construction of Mycobacterium tuberculosis folB-GFP fusion (Mtb) strains containing wild-type folB gene sequence or a deleted C-terminal mutant (folBΔC), devoid of the sequence presumably necessary for anchoring the enzyme within nanocage compartments, were performed and together with other cell biology methods described in this work will be used for a better understanding of MtDHNA/FolB cellular functions and for the validation of this enzyme as a therapeutic target. |
