Identificação de espécies de carnívoros (mammalia, carnívora) utilizando sequências de DNA e sua aplicação em amostras não-invasivas

Abstract

Sequências de DNA usadas na identificação de material biológico têm alcançado considerável popularidade nos últimos anos, especialmente no contexto dos códigos de barras de DNA. Aferir a espécie de origem em amostras de pelos, penas, peles e particularmente fezes é um passo fundamental para quem estuda a ecologia e evolução de diversos animais com este tipo de amostra. Este é o caso em carnívoros, cujos hábitos furtivos e baixas densidades populacionais de algumas espécies evidenciam a importância de estudos baseados em amostras não-invasivas. Entretanto a atual escassez de ensaios padronizados de identificação de carnívoros freqüentemente dificulta a aplicação dessas amostras em larga escala e comparações de resultados entre diferentes localidades. No presente estudo nós avaliamos dois segmentos curtos (<250 pb) de DNA mitochondrial (mtDNA) localizados nos genes ATP sintase 6 e citocromo oxidase I com potencial de servirem como marcadores-padrão para identificação de carnívoros. Entre um e 11 indivíduos de 66 espécies de carnívoros foram seqüenciados para um ou ambos os segmentos do mtDNA e analisados usando três diferentes métodos (árvore de distância, distância genética e análise de caracteres). Em geral, indivíduos conspecíficos apresentaram menor distância genética entre si do que em relação a outras espécies, formando agrupamentos monofiléticos.Exceções foram algumas espécies que divergiram recentemente, algumas das quais ainda puderam ser identificadas pelo método de caracteres, haplótipos espécie-específicos, ou reduzindo a abrangência geográfica das comparações (restringindo a análise a uma região zoogeográfica). Análises in silico, usando um segmento curto do citocromo b freqüentemente empregado em carnívoros, também foram realizadas para comparar o desempenho deste segmento em relação aos outros dois propostos. Nós então testamos o desempenho destes segmentos na identificação de fezes de carnívoros por meio de três estudos de caso: (i) fezes de felinos de zoológico, objetivando-se verificar o potencial de contaminação das seqüencias com DNA da presa (coelho); (ii) fezes coletadas no Cerrado brasileiro contendo restos de presas (pêlos, ossos, penas), supostamente proveniente de lobo-guará, objetivando-se investigar a eficiência de identificação do predador e ocorrência de interferência do DNA da presa na identificação; e (iii) fezes coletadas em uma reserva na Mata Atlântica, também com o objetivo de avaliar a eficiência de identificação. Apesar de diferenças em alguns aspectos de sua performance, nossos resultados indicam que os dois segmentos propostos têm um bom potencial de servir como marcadores moleculares eficientes para identificação acurada de amostras de carnívoros ao nível de espécie.

DNA sequences for species-level identification of biological materials have achieved considerable popularity in the last few years, especially in the context of the DNA barcoding initiative. Species assignment of biological samples such as hairs, feathers, pelts and particularly faeces is a crucial step for those interested in studying ecology and evolution of many species with these samples. This is especially the case for carnivores, whose elusive habits and low densities highlight the importance of studies based on noninvasive samples. However, the current lack of standardized assays for carnivore identification often poses challenges to the large-scale application of this approach, as well as the cross-comparison of results among sites. Here we evaluate the potential of two short (<250 pb) mitochondrial DNA (mtDNA) segments located within the genes ATP synthase 6 and cytochrome oxidase I as standardized markers for carnivore identification. Between one and eleven individuals of 66 carnivore species were sequenced for one or both of these mtDNA segments and analyzed using three different approaches (tree-based, distance-based and character-based), in conjunction with sequences retrieved from public databases. In most cases, conspecific individuals had lower genetic distances from each other relative to other species, resulting in diagnosable monophyletic clusters.Notable exceptions were the more recently diverged species, some of which could still be identified using diagnostic character attributes, species-specific haplotypes, or by reducing the geographic scope of the comparison (restricting the analysis to a single zoogeographic region). Additional in silico analyses using a short cytochrome b segment frequently employed in carnivore identification were also performed aiming to compare performance to that of our two focal markers. We then tested the performance of these segments in the identification of carnivore faeces via three case studies: (i) felid faeces collected in a controlled zoo experiment, aimed at assessing whether DNA from rabbit prey would contaminate the resulting sequences; (ii) field-collected faeces from the Brazilian Cerrado presumed to be from maned wolves and containing prey remains (hairs, bones, feathers), aimed at investigating the efficiency of predator identification and occurrence of prey DNA interference; and (iii) field-collected scats from an Atlantic Forest study site, also addressing the issue of PCR success rate and identification efficiency. In spite of some relevant differences in some aspects of their performance, our results indicate that both of our focal segments have a good potential to serve as efficient molecular markers for accurate species-level identification of carnivore samples.