| Resumo: | Fosfodiesterase (PDE) é uma super família de enzimas responsáveis pela degradação dos segundos mensageiros intracelulares adenosina monofosfato cíclico (AMPc) e guanosina monofosfato cíclico (GMPc). Como reguladoras essenciais na sinalização de segundos mensageiros cíclicos com diversas funções fisiológicas as PDEs são alvo de drogas para o tratamento de diversas doenças. Dentre estas estão insuficiência cardíaca, depressão, asma, inflamação e disfunção erétil. Dentre as 11 famílias de genes de PDE, a fosfodiesterase 5 (PDE5) é específica para GMPc, sendo responsável pela atividade de hidrólise que sofre o GMPc dentro dos tecidos dos corpos cavernosos penianos dos homens. A PDE5 é amplamente conhecida por ser alvo de diversas drogas utilizadas no tratamento da disfunção erétil, como por exemplo, o sildenafil (Viagra®). Este trabalho tem por objetivo a síntese da região codificante, clonagem, expressão e purificação do domínio catalítico da PDE5 humana. A síntese da região codificante do polipeptídeo alvo foi realizada através da técnica de overlap, utilizando 24 oligonucleotídeos que foram unidos através da reação em cadeia da polimerase (PCR). A construção foi clonada em vetor pCRBlunt® e sequenciada para confirmar sua identidade e a ausência de mutações. O fragmento foi subclonado em vetor de expressão pET23a(+) com sítios de restrição NdeI e BamHI, para o N terminal e C terminal, respectivamente. Células eletrocompetentes de E. coli Rosetta (DE3) foram transformadas com o plasmídeo recombinante, a região que codifica para o domínio catalítico da PDE5 foi expressa em sua forma solúvel e ativa na presença de 0,1 mM do indutor IPTG. Quando o domínio catalítico da PDE5 foi isolado, um rendimento de 2,39 mg. mL-1 foi obtido através de 3 passos de purificação.O domínio catalítico da PDE5 puro permitirá a realização de uma triagem de extratos vegetais oriundos da biodiversidade brasileira. Com o intuito de buscar novos compostos que possam se tornar possíveis inibidores de PDE5, e assim serem utilizados no tratamento da disfunção erétil.
Phosphodiesterases (PDEs) are a super family of enzymes which degrade the intracellular second messengers cyclic guanosine monophosphate (cGMP) and cyclic adenosine monophosphate (cAMP). As essential regulators in cyclic nucleotide signaling with diverse physiological functions, PDEs are drug targets for the treatment of various diseases including heart failure, depression, asthma, inflammation, and erectile dysfunction. Among the eleven PDE gene families, the cGMP-specific PDE5 is the principal cGMP-hydrolyzing activity in the human corpus cavernosum tissue. It is well known as the target of many drugs used in the treatment of erectile dysfunction, like sildenafil. This work aims the synthesis of the coding region, cloning, expression and purification of the catalytic domain of human PDE5 gene which encodes the phosphodiesterase 5. The synthesis of the coding region of the target polypeptide was accomplished by using 24 primers, which were ligated by overlap extension using the polymerase chain reaction. The construction was cloned into pCRBlunt® vector and sequenced to confirm its identity and the absence of mutations. The fragment was subcloned into pET23a(+) expression vector with NdeI and BamHI restriction sites. Escherichia coli Rosetta (DE3) electrocompetent cells were transformed with the recombinant plasmid and the coding region of the catalytic domain of the PDE5 was expressed in its soluble form with 0. 1mM of IPTG induction. The purification yielded 2. 39 mg. mL-1 through 3 steps of purification. The pure catalytic domain of PDE5 will allow screening for the discovery of new natural inhibitors from the brazilian biodiversity that could be used in the treatment of erectile dysfunction. |
