Caracterização da atividade da enzima catalase-peroxidase (KatG) de mycobacterium tuberculosis frente ao composto IQG-607

Abstract

A tuberculose (TB) é uma doença infecciosa causada principalmente pelo Mycobacterium tuberculosis (Mtb) e é responsável por milhões de mortes. Além disso, novas cepas de Mtb resistentes aos medicamentos para TB estão surgindo e se espalhando. Em particular, o principal fármaco de primeira linha para a TB, a isoniazida (INH), precisa ser ativada dentro das células micobacterianas pela enzima catalase-peroxidase KatG para exercer sua atividade antimicrobiana, e as mutações no gene katG são uma das principais causas de resistência a INH. O IQG-607 é um composto metálico análogo da INH que foi desenvolvido para inibir o mesmo alvo de INH, a enzima do sistema FAS-II enoil-ACP-redutase (InhA), sem a necessidade de ativação pela KatG. No entanto, foi mostrado recentemente que, dentro das células micobacterianas, a atividade do IQG-607 também depende da KatG. Portanto, assim como a INH, esse composto também pode se comportar como um pró-fármaco, necessitando de ativação pela KatG para poder inibir a InhA. Para testar essa hipótese, foi avaliada a capacidade de uma KatG recombinante de Mtb (MtKatG) em utilizar o IQG-607 como substrato em reações de oxidação e na formação de adutos com NAD+. A MtKatG recombinante foi produzida em E. coli e, posteriormente, purificada em um protocolo de três etapas para obter uma proteína homogênea. Um método baseado em HPLC foi otimizado para monitorar os produtos de oxidação e formação de adutos, e nosso sistema de ensaio foi validado por meio de reações controle usando INH como substrato. Foi observado que o composto IQG-607 não é um substrato para a MtKatG recombinante em todas as condições testadas. Com base nesses resultados, sugere-se que o composto IQG-607 possa se comportar como um pré-profármaco, liberando a porção INH dentro das células micobacterianas, que, por sua vez, atuaria como um pró-fármaco, requerendo a ativação da KatG para formar o aduto ativo INH-NAD.

Tuberculosis (TB) is an infectious disease caused mainly by Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and is responsible for millions of deaths. Moreover, new Mtb strains resistant to TB drugs are emerging and spreading. In particular, the main first-line TB drug, isoniazid (INH), must be activated inside mycobacterial cells by the catalase-peroxidase enzyme KatG to exert its antimicrobial activity, and mutations on the katG gene are a major cause of INH resistance in clinics. The metal-containing compound IQG-607 is an INH analogue that was developed to inhibit the same target of INH, the FASII enzyme enoyl-ACP-reductase (InhA), without requiring activation by the KatG. However, we showed recently that inside mycobacterial cells the activity of IQG-607 is also dependent on KatG. Hence, this compound might also be activated by KatG, requiring its activation to inhibit InhA. Therefore, we evaluated the ability of recombinant MtKatG to use IQG-607 as a substrate in oxidation reactions and for adduct formation with NAD+. A recombinant MtKatG was produced in E. coli and purified in a 3-step protocol to obtain a homogenous protein. An HPLC method was optimized to monitor both oxidation and adduct products, and our assay system was validated by performing control reactions using INH as a substrate. We found that the metal-based compound IQG-607 is not a substrate for recombinant MtKatG under all tested conditions. Based on our results, we suggest that IQG-607 might behave as a pre-prodrug, releasing the INH moiety inside mycobacterial cells, which then requires KatG activation to form the active INH-NAD adduct.