| Abstract: | O consumo de etanol está inserido em muitas culturas ao redor do mundo. No entanto, seu consumo crônico adulto ou por gestantes pode levar a mudanças transitórias ou permanentes no sistema nervoso central (SNC). Esses distúrbios na sinalização neuronal podem culminar em episódios convulsivos. Nesse contexto, a sinalização adenosinérgica é capaz de atuar como anticonvulsivante endógeno através da sua ação neuromoduladora. As perturbações dessa sinalização podem acarretar alterações na suscetibilidade a crises convulsivas conforme o estágio de desenvolvimento em que a perturbação ocorre e o tempo de exposição do agente perturbador. Esta tese compreende três trabalhos experimentais que abordam diferentes aspectos da relação entre o sistema adenosinérgico e a suscetibilidade a crises convulsivas associadas à exposição ao etanol em diferentes fases do desenvolvimento em peixe-zebra. No primeiro trabalho, avaliamos a expressão e funcionalidade do receptor A1 de adenosina ao longo de três fases de desenvolvimento: larval (6 dias pós-fertilização, dpf), adulta (8 meses pós- fertilização, mpf) e idosa (24 mpf). A funcionalidade do receptor A1 foi avaliada através da resposta lomocotora basal e da sensibilidade ao pro-convulsivante pentilenotetrazol (PTZ) à adenosina e ao agonista rígido CPA (N6- ciclopentiladenosina) em diferentes doses e concentrações ao longo do desenvolvimento. O uso da adenosina pura não foi capaz de promover o conhecido efeito hipolocomotor, mesmo em concentrações e doses altas, como 500 μM para larvas e 6 mg.Kg-1 para adultos, respectivamente. O CPA promoveu hipolocomoção em larvas a partir da concentração de 100 μM e para adultos a partir da dose de 20 mg.Kg-1. O efeito anticonvulsivante do CPA foi alcançado nas doses de 75 μM para larvas e 10 mg.Kg-1 para adultos. A expressão gênica relativa do receptor A1 de adenosina aumentou 9,3 e 8,4 vezes em animais de 8 e 24 mpf em relação as larvas de 6 dpf, respectivamente. No segundo manuscrito, avaliamos o envolvimento da adenosina na suscetibilidade à convulsão de animais adultos após a exposição e a abstinência ao etanol. Animais adultos foram submetidos diariamente por uma hora ao etanol (0,5%) por 16 dias (exposição contínua) ou por 8 dias seguidos de 8 dias ou 1 dia de abstinência ao etanol. A sensibilidade à convulsão foi demonstrada pelo aumento do número de animais atingindo convulsões tônico-clônicas nos grupos abstidos de etanol (1 ou 8 dias) mesmo em dose subconvulsivante de PTZ. O CPA foi capaz de prevenir o desenvolvimento destas crises convulsivas nos animais abstidos de etanol na dose de 10 mg.Kg-1. A avaliação da expressão de gênica dos receptores A1 e A2aa/A2ab de adenosina e da enzima ecto-5’-nucleotidase em encéfalo, revelou que o grupo abstido (1 dia) teve a expressão gênica do receptor A1 reduzida em relação aos demais grupos. No terceiro trabalho, avaliamos a suscetibilidade às crises convulsivas em animais submetidos a um modelo de Síndrome Alcoólica Fetal e o possível envolvimento da adenosina. Para isso, foi feita uma exposição única a 1% de etanol em embriões de peixe-zebra entre 24 e 26 horas pós-fertilização. A suscetibilidade a convulsões induzidas por PTZ e o efeito anticonvulsivante do CPA foram avaliados em larvas de 7 dpf e adultos de 3 mpf. A exposição embrionária ao etanol não foi capaz de aumentar a suscetibilidade à crise convulsiva, visto que o número de animais convulsionando não diferiu entre os grupos tratado e controle. No entanto, para os estágios convulsivos alcançados no estágio larval, estágios I e II, a latência (I e II) e a duração (I) diferiram entre os grupos, indicando uma maior sensibilidade nos animais expostos ao etanol. Na idade adulta, a exposição embrionária ao etanol não alterou o número de animais atingindo estágios convulsivos, bem como a latência ou duração destes estágios. Estes resultados contribuem para a importância da manutenção do curso normal da modulação adenosinérgica ao longo do desenvolvimento, em especial do papel do receptor A1 de adenosina no contexto da sensibilidade ao etanol, bem como da contribuição da adenosina para o aumento da sensibilidade à convulsão em indivíduos adultos abstidos de etanol.
Ethanol consumption is embedded in many cultures around the world. However, its chronic consumption in adults or during pregnancy can lead to transient or permanent changes in the central nervous system (CNS). These disturbances in neuronal signaling include behavioral effects that can culminate in seizure episodes. In this context, adenosinergic signaling is an endogenous anticonvulsant through its neuromodulatory action. Disturbances in this signaling pathway can lead to changes in susceptibility to seizures depending on the stage of development in which the disturbance occurs and the time of exposure to the disturbing agent. This thesis comprises three experimental studies that address different aspects of the relationship between the adenosinergic system and susceptibility to seizures associated with exposure to ethanol at different stages of development in zebrafish. In the first study, we evaluated the expression and functionality of the adenosine A1 receptor throughout three developmental stages: larval (6 days post-fertilization, dpf), adult (8 months post- fertilization, mpf) and old (24 mpf). The functionality of the A1 receptor was evaluated through the baseline locomotor response and sensitivity to the proconvulsant pentylenetetrazole (PTZ) to adenosine and the rigid agonist CPA (N6- cyclopentyladenosine) at different doses and concentrations throughout development. The use of adenosine per se was not able to promote the known hypolocomotor effect, even at high concentrations and doses, such as 500 μM for larvae and 6 mg.Kg-1 for adults, respectively. CPA promoted hypolocomotion in larvae from a concentration of 100 μM and in adults from a dose of 20 mg.Kg-1 . The anticonvulsant effect of CPA was achieved at doses of 75 μM for larvae and 10 mg.Kg-1 for adults. The relative gene expression of the adenosine A1 receptor increased 9.3 and 8.4 times in 8 and 24 mpf animals compared to 6 dpf larvae, respectively. In the second manuscript, we evaluated the involvement of adenosine in the seizure susceptibility of adult animals after exposure and abstinence to ethanol. Adult animals were submitted daily for one hour to ethanol (0.5%) for 16 days (continuous exposure) or for 8 days followed by 8 days or 1 day of abstinence from ethanol. Seizure sensitivity was demonstrated by the increased number of animals achieving tonic-clonic seizures in the ethanol abstained groups (1 or 8 days) even at subconvulsant dose of PTZ. CPA was able to prevent the development of these seizures in animals abstaining from ethanol at a dose of 10 mg.Kg-1. The evaluation of the gene expression of the A1 and A2aa/A2ab adenosine receptors and the ecto-5'-nucleotidase enzyme in the brain revealed that the abstained group (1 day) had a reduced gene expression of the A1 receptor in relation to the other groups. In the third study, we evaluated the susceptibility to seizures in animals submitted to a model of Fetal Alcohol Syndrome and the possible involvement of adenosine. For this, a single exposure to 1% ethanol was performed on zebrafish embryos between 24 and 26 hours post-fertilization. The susceptibility to PTZ-induced seizures and the anticonvulsant effect of CPA were evaluated in 7 dpf larvae and 3 mpf adults. Embryonic exposure to ethanol was not able to increase susceptibility to seizures, as the number of animals convulsing did not differ between treated and control groups. However, for the convulsive stages reached in the larval stage, stages I and II, latency (I and II) and duration (I) differed between groups, indicating a greater sensitivity in animals exposed to ethanol. In adulthood, embryonic exposure to ethanol did not alter the number of animals reaching convulsive stages, as well as the latency or duration of these stages. These results contribute to the importance of maintaining the normal course of adenosinergic modulation throughout development, in particular the role of the adenosine A1 receptor in the context of ethanol sensitivity, as well as the contribution of adenosine to the increased sensitivity to seizures in adults abstained from ethanol. |
