A utilização do cimento de fosfato de cálcio como arcabouço para engenharia de tecido ósseo: estudo in vitro

Abstract

A engenharia tecidual tem se mostrado um campo promissor para a reabilitação de pacientes com traumas ou deformidades faciais que necessitem de áreas extensas de enxerto ósseo. Seu princípio básico envolve a associação de um tipo apropriado de célula e de um arcabouço biocompatível e bioabsorvível que mimetize funcional e estruturalmente determinado tipo de tecido. O Cimento de Fosfato de Cálcio (CFC) aparece como uma alternativa viável de biomaterial a ser utilizado com esta finalidade em virtude de suas características como biocompatibilidade, bioatividade e osteocondutividade. Assim, o objetivo da presente pesquisa foi avaliar a capacidade de suportes tridimensionais macroporosos de CFC, confeccionados com matérias-primas brasileiras, de permitir a adesão, proliferação e diferenciação de células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea humana. Para isso, células obtidas da crista ilíaca de um doador humano adulto foram rotineiramente processadas até as condições experimentais e, a seguir, cultivadas sobre suportes de CFC, macroporosos, que tiveram como corpo gerador de poros, microesferas de parafina, com tamanho entre 100 e 250μm. Para indução das células em linhagem osteogênica foi acrescentada Proteína Morfogênica Óssea (BMP4) ao meio de cultura. Os períodos de cultura estabelecidos foram de cinco, dez e 15 dias. Após estes períodos, o comportamento e a morfologia das células junto ao biomaterial foram avaliados por meio de Microscopia Eletrônica de Varredura.Os níveis de expressão dos genes BGLA e SSP1, que codificam as proteínas osteocalcina (OC) e osteopontina (OP) respectivamente, bem como a atividade da Fosfatase Alcalina (ALP), outro marcador osteoblástico importante, foram quantificados pela técnica de PCR em Tempo Real (QT-PCR) utilizando o fluoróforo SYBR Green®. O QT-PCR detectou a expressão dos genes BGLA e SSP1 e a atividade da fosfatase alcalina nos períodos de 10 e 15 dias de cultura, o que nos permitiu constatar que houve proliferação celular e diferenciação destas em células osteogênicas. No período de cinco dias, não foi observada a expressão de nenhum dos genes investigados. A partir destes resultados concluímos que o CFC, macroporoso, com tamanho de poros entre 100 e 250μm, criados por meio da utilização de microesferas de parafina, permite a adesão, proliferação e diferenciação de células-tronco mesenquimais em células osteogênicas, podendo ser utilizado como arcabouço para engenharia de tecido ósseo.

Tissue engineering has been showing a promising approach on the treatment of patients with trauma or facial deformities that need extensive areas of bone grafts. It involves the association of an appropriate kind of cell and a biocompatible and biodegradable scaffold that imitates functionally and structurally a specific kind of tissue. Calcium Phosphate Cement (CFC) appears as an interesting alternative of biomaterial to be used as a scaffold due to its characteristics as biocompatibility, bioactivity and osteoconductivity. Thus, the aim of the present study was to evaluate the ability of macroporous tridimensional CFC scaffolds, made with brazilian rawmaterial, to allow the adhesion, proliferation and differentiation of mesenchymal stem cells, derived from human bone marrow in cells osteogenic lineage. For that, cells obtained from iliac crest of an adult human donor were routinely processed until experimental conditions and, after that, cultured over CFC discs, macroporous that had as poror generation body, paraffin spheres, with size between 100 and 250μm. For the induction of cells in osteogenic lineage, BMP4 was added to the culture. Culture periods were established in five, ten and fifteen days. After these periods cells were evaluated due to their morphology by Scanning Electron Microscopy. The expression levels of genes BGLA and SSP1, that codify the osteocalcine (OC) and osteopontine (OP) proteins, as well as the Alkaline phosphatase activity (ALP), other important osteoblastic marker , were quantified by the PCR technique in real time QT-PCR) using the fluorophore SYBR GREEN® . The QT-PCR detected the expression of the genes BGLA and SSP1 and the alkaline phosphatase activity in the periods of 10 and 15 days of culture, what permitted them to check that had a cell proliferation and the differentiation of it in osteogenic cells.In the period of five days, it was not observed the expression of any observed genes. From theses results we concluded that the macroporous CFC, with pore size between 100 and 250 μm, created through the utilization of the paraffin microspheres, permits the adhesion, proliferation and differentiation of mesenchymal stem cells and can be used as an scaffold to the bone tissue engineering.