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Tipo: doctoralThesis
Título: Detecção e quantificação de células viáveis de Bacillus sporothermodurans e de Bacillus cereus em leite através de PCR convencional e de PCR em tempo real associadas ao propídio monoazida
Autor(es): Cattani, Fernanda
Orientador: Oliveira, Silvia Dias de
Editor: Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul
Programa: Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Fecha de Publicación: 2012
Palabras clave: BIOLOGIA MOLECULAR
BIOLOGIA CELULAR
MICROBIOLOGIA
LATICÍNIOS
ALIMENTOS - MICROBIOLOGIA
Resumen: The presence of Bacillus spp. in milk is an important problem for the dairy industry due to their capability of sporulation and the possibility of spore resistance to heat treatment by ultra high temperature (UHT). Bacillus sporothermodurans survive to the UHT system, germinating and growing in stored milk and, if not correctly identified and quantified, can exceed the criterion established for mesophilic aerobic, besides altering the quality of dairy products when in high concentrations. On the other hand, contamination of milk by Bacillus cereus is not only an important cause of deterioration, but is also associated with the occurrence of diarrhea and emetic syndromes. Traditionally, these microorganisms are identified and quantified in food using conventional microbiological techniques, but the Polymerase Chain Reaction (PCR) based methods have been widely used for the same purpose. However, PCR cannot distinguish between viable and dead cells, which can be overcame with the use of DNA intercalating, such as propidium monoazide (PMA). PMA binds to DNA derived from cells with damaged membranes, preventing their amplification by PCR, allowing, thus, the selective detection of viable cells. Therefore, this thesis aimed to characterize the thermal resistance of B. sporothermodurans and to develop methods of detection and quantificatification of viable cells of B. sporothermodurans and B. cereus in milk samples by qPCR associated with PMA. Isothermal and non-isothermal treatments allowed the determination of the profile of heat resistance of B. sporothermodurans spores to heat UHT process, predicting that to 121°C was found a D value between 2 a 4 min. The selective detection and quantification of B. sporothermodurans and B. cereus by PMA-qPCR were developed targeting 16S rRNA gene and hemolysin gene, respectively. The treatment with PMA from pure culture and artificially contaminated UHT milk were standardized by end-point PCR for the detection of viable cells of these microorganisms. The inhibition of amplification of DNA from dead cells was obtained at a concentration of 30μg/mL PMA. The standardization of qPCR assays were performed using hydrolysis probes (TaqMan® system) specific to each target gene. The quantification limit from UHT milk artificially contaminated was 2. 5 x 102 CFU/mL for B. sporothermodurans and 7. 5 x 102 CFU/mL for B. cereus. The assays were applied to 135 samples of UHT milk of different commercial brands, comparing with the conventional method of cultivation for each microorganism. B. sporothermodurans and B. cereus were respectively detected in 14 (10. 4%) and 44 (32. 6%) of the samples by molecular methods developed, and in 11 (8. 1%) and 15 (11. 1%) by conventional culturing methods. The PMA-qPCR methods developed in this study were specific and sensitive for the detection and quantification of viable B. sporothermodurans and B. cereus cells, being applicable for the evaluation of milk samples, reducing the time for the analysis of this product. Furthermore, the results showed that B. cereus can be found in UHT milk.
A presença de Bacillus spp. em leite representa um importante problema para a indústria de laticínios devido à sua capacidade de esporulação e à possibilidade de resistência do esporo ao tratamento térmico por ultra alta temperatura (UAT). O Bacillus sporothermodurans sobrevive ao sistema UHT, germinando e se multiplicando no leite estocado e, caso não seja corretamente quantificado e identificado, pode ultrapassar o limite estabelecido pela legislação para microrganismos mesófilos aeróbios, além de alterar a qualidade dos produtos lácteos quando em altas concentrações. Por outro lado, a contaminação de leite por Bacillus cereus constitui não somente uma importante causa de deterioração, mas também está associada com a ocorrência das síndromes emética e diarreica. Tradicionalmente, estes microrganismos são identificados e quantificados em alimentos através de técnicas clássicas de cultivo, mas métodos baseados na Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) também têm sido amplamente utilizados. Entretanto, a PCR não distingue células mortas de células viáveis, o que pode ser contornado com o emprego de intercalantes de DNA, como o propídio monoazida (PMA). O PMA se liga ao DNA derivado de células com membranas rompidas, impedindo suas amplificações na PCR, permitindo, assim, a detecção seletiva de células viáveis. Portanto, a presente tese teve por objetivo caracterizar a resistência térmica de B. sporothermodurans, bem como desenvolver métodos de detecção e quantificação de células viáveis de B. sporothermodurans e de B. cereus em amostras de leite através de PCR associada ao PMA. Tratamentos isotérmicos e não isotérmicos permitiram a determinação do perfil de resistência térmica de esporos de B. sporothermodurans ao processo UHT, predizendo que a 121°C foi encontrado um valor D entre 2 a 4 min.A detecção e quantificação seletivas de B. sporothermodurans e de B. cereus através de PMA-qPCR foram desenvolvidas utilizando o gene RNAr 16S e o gene da hemolisina como alvos, respectivamente. O tratamento com PMA a partir de cultura pura e leite UHT artificialmente contaminado foi padronizado através da PCR convencional para a detecção de células viáveis destes microrganismos. A inibição da amplificação de DNA de células mortas foi obtida na concentração de 30μg/mL de PMA. A padronização dos ensaios de qPCR foram realizados utilizando sondas de hidrólise (sistema TaqMan®) específicas para cada gene alvo. O limite de quantificação a partir de leite UHT artificialmente contaminado foi de 2,2 x 102 UFC/mL para B. sporothermodurans e de 7,5 x 102 UFC/mL para B. cereus. As técnicas foram aplicadas a 135 amostras de leite UHT de diferentes marcas comerciais, comparando com a metodologia clássica de cultivo para cada microrganismo. B. sporothermodurans e B. cereus foram, respectivamente, detectados em 14 (10,4%) e 44 (32,6%) das amostras analisadas pelos métodos moleculares desenvolvidos, e em 11 (8,1%) e 15 (11,1%) pelos métodos convencionais de cultivo. Os métodos de PMA-qPCR desenvolvidos neste estudo foram específicos e sensíveis para a detecção e quantificação de células viáveis de B. sporothermodurans e de B. cereus, mostrando-se aplicáveis para serem utilizados na avaliação de amostras de leite, reduzindo o tempo de análise deste produto. Além disso, os resultados demonstraram que B. cereus pode ser encontrado em leite tratado pelo sistema de UHT.
URI: http://hdl.handle.net/10923/1351
Aparece en las colecciones:Dissertação e Tese

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