Utilize este identificador para citar ou criar um atalho para este documento: http://hdl.handle.net/10923/5485
Tipo: doctoralThesis
Título: A enzima hidrolase de nucleosídeos purínicos de Mycobacterium tuberculosis H37RV: caracterização bioquímica, termodinâmica e estudos de nocaute gênico
Autor(es): Wink, Priscila Lamb
Orientador: Santos, Diógenes Santiago
Editora: Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul
Programa: Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Data de Publicação: 2013
Palavras-chave: BIOLOGIA MOLECULAR
BIOLOGIA CELULAR
TUBERCULOSE
ENZIMAS
Resumo: Human tuberculosis (TB) is a major global health threat. The disease’s increasing prevalence, coupled with the emergence of drug-resistant strains and the devastating effects of co-infection with human immunodeficiency virus (HIV) indicate an urgent need for the development of new and more efficient drugs to combat the disease's causative agent, Mycobacterium tuberculosis. Global health authorities have also begun to recognize the need for drugs that can kill the mycobacteria in its different physiological states including but not limited to latent TB infection. A more comprehensive understanding of the bacilli's nucleotide metabolic pathways, in particular purine and pyrimidine salvage pathways, could aid in the development of new therapeutic strategies to reduce the incidence of TB worldwide. Nucleoside hydrolase catalyzes the irreversible hydrolysis of N-glycosidic bond of ribonucleosides, forming α-D-ribose and the corresponding base. This work describes the amplification, cloning, expression and purification of the iunH-encoding purine nucleoside hydrolase from M. tuberculosis (MtIAGU-NH). Results from steadystate kinetic experiments indicate that MtIAGU-NH has broad substrate specificity, accepting inosine, adenosine, guanosine, and uridine as substrates. Kinetics analysis utilizing fluorescence spectroscopy of ribose binding to MtIAGU-NH suggests that prior to ligand association there are two pre-existing forms of the enzyme. We determined the intracellular concentrations of inosine, uridine, hypoxanthine, and uracil as well as the reaction’s thermodynamic parameters. Thermodynamic activation parameters (Ea, ΔG#, ΔS#, ΔH#) for the MtIAGU-NH-catalyzed chemical reaction, along with results from mass spectrometry, isothermal titration calorimetry (ITC), pH-rate profile experiments, multiple sequence alignment, and molecular docking experiments are also presented. Knockout experiments of the iunH gene indicate that this gene is not essential for the growth of M. tuberculosis H37Rv underutilized experimental conditions. The data presented here contribute to our understanding of MtIAGU-NH, providing a solid basis for the development of efficient prophylactic and therapeutic strategies to reduce the global incidence of TB.
A tuberculose humana (TB) é considerada uma ameaça à saúde global. O aumento na prevalência da doença, a emergência de cepas resistentes e a coinfecção com o vírus da imunodeficiência humana levaram à urgente necessidade do desenvolvimento de novas drogas mais eficientes para o combate do agente causativo da TB, Mycobacterium tuberculosis. Além disso, há a necessidade de novas drogas contra a micobactéria nos seus diferentes estados fisiológicos, incluindo a TB latente. Um maior entendimento sobre as vias metabólicas de nucleotídeos do bacilo da TB, em particular as vias de salvamento de purinas e pirimidinas, levariam ao desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para controlar a incidência global de TB. A hidrolase de nucleosídeos catalisa a hidrólise irreversível da ligação N-glicosídica de ribonucleosídeos, dando origem à α-D-ribose e sua base livre correspondente. Este trabalho descreve a amplificação e clonagem do gene iunH, e a expressão e purificação da enzima recombinante hidrolase de nucleosídeos purínicos de M. tuberculosis (MtIAGU-NH). Os resultados de cinética no estado estacionário mostram que a MtIAGU-NH possui uma ampla especificidade pelos substratos, utilizando inosina, adenosina, guanosina e uridina como substratos. As medidas cinéticas da ligação da ribose à MtIAGU-NH por espectroscopia fluorimétrica sugerem a existência de duas formas da enzima em equilíbrio, relacionadas à associação ao ligante. As concentrações intracelulares de inosina, uridina, hipoxantina e uracil foram determinadas e os parâmetros termodinâmicos, estimados. Os parâmetros termodinâmicos de ativação (Ea, ΔG#, ΔS#, ΔH#) para a reação química catalisada pela MtIAGU-NH, além dos resultados de espectrometria de massa, calorimetria de titulação isotérmica, experimento de perfil de pH, alinhamento de múltiplas sequências e experimentos de docagem molecular também são apresentados neste trabalho. O nocaute do gene iunH mostrou que este não é essencial para o crescimento do bacilo M. tuberculosis H37Rv nas condições experimentais empregadas. Os resultados aqui descritos deverão ser úteis para um melhor entendimento sobre a enzima MtIAGU-NH, fornecendo bases sólidas para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas e preventivas para diminuir a incidência global da TB.
URI: http://hdl.handle.net/10923/5485
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