Produção da proteína recombinante estreptoquinase (Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis) em biorreator utilizando diferentes estratégias de batelada alimentada

Abstract

Streptokinase (SK) is a group of extracellular proteins produced by a variety of streptococci beta-hemolytic strains, and is a plasminogen activator composed of 414 amino acids with a molecular mass of 47 kDa. SK forms a high affinity equimolar complex with a plasminogen. The resulting complex can convert plasminogen to plasmin, the active protease that degrades fibrin in the blood clot. This protein is now widely used as a thrombolytic agent in the treatment of acute myocardial infarction and others circulatory disorders. The low SK production yields from natural host and its pathogenicity are the main reasons for exploration of recombinant DNA technology route for this important protein. Escherichia coli is the most commonly used host for heterologous protein production and the preferred method for increasing the concentration of heterologous recombinant protein, which is proportional to both cell density and specific cellular product yield, is the fed-batch strategy. Being the Brazil totally dependent on the import of this biopharmaceutical, an alternative to streptokinase was the production of this biopharmaceutical by recombinant DNA techniques with expression experiments and bioreactor cultivation, purification and the protein activity assay of the recombinant streptokinase. In this work were performed SKC bioreactor cultivations through fed-batch techniques, testing different feeding media, feeding strategies and induction time with IPTG, After defining the best conditions for growing the recombinant protein was purified and its homogeneous form was used to perform of biological activity assay. The maximum biomass achieved was 18. 94 g/L in LB medium using linear fed-batch strategy in the presence of glucose and MgSO4. Approximately 21 mg of homogeneous SKC were obtained from 2 g of wet weight cells using a three-step protocol with two chromatography columns. When compared to an International standard in a colorimetric assay, the specific activity of SKC was approximately 99%, showing that recombinant SKC has a very similar specific activity to the standard.

A estreptoquinase (SK) é uma proteína extracelular produzida por uma variedade de linhagens de Streptococcus beta-hemolíticos, é uma proteína ativadora do plasmigênio composta de 414 aminoácidos com uma massa molecular de aproximadamente 47 kDa. A SK forma um complexo equimolar com o plasminogênio. Esse complexo resultante pode converter diretamente outra molécula de plasminogênio em plasmina, a protease ativa que degrada a fibrina presente nos coágulos sanguíneos. Esta enzima é hoje amplamente usada como agente trombolítico no tratamento do infarto agudo do miocárdio e outras desordens circulatórias. A baixa produtividade da estreptoquinase a partir das células de Streptococcus e a patogenicidade deste microorganismo são as principais razões para a exploração da tecnologia de DNA recombinante para produção desta importante proteína. Escherichia coli é o microorganismo mais comum utilizado para produção de proteínas heterólogas e o método de preferência para o aumento da concentração de proteínas recombinantes proporcional à densidade de células e produção de produtos específicos da célula, é a estratégia em bateladaalimentada. Sendo o Brasil totalmente dependente da importação de biofármacos, uma alternativa à estreptoquinase seria a produção desse biofármaco por meio de técnicas de DNA recombinante com experimentos de superexpressão e cultivo em biorreator, purificação e o ensaio de atividade da proteína estreptoquinase recombinante. Neste trabalho foram realizados cultivos de estreptoquinase de Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis grupo C (SKC) em biorreator através de técnicas de batelada alimentada, testando diferentes meios de alimentação, estratégias de alimentação e tempos de indução com IPTG. Após definidas as melhores condições de cultivo a proteína recombinante foi purificada e sua forma homogênea foi utilizada para realização dos ensaios de atividade biológica. A máxima biomassa alcançada foi de 18,94 g/L em meio de cultura Luria - Bertani (LB) usando uma estratégia de alimentação linear na presença de glicose e MgSO4. Aproximadamente 21 mg de SKC homogênea foram obtidas a partir de 2 g de célula úmida usando um protocolo de purificação de três etapas com duas colunas cromatográficas. Quando comparada com o Padrão Internacional no ensaio colorimétrico, a atividade específica de SKC foi de aproximadamente 99%, mostrando que a SKC recombinante obteve uma atividade especifica muito similar ao padrão.